專利名稱：高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，主要是ー種高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段及應用。
背景技術：
小麥是世界第一大糧食作物。同其它作一祥，小麥也經常受到病蟲的侵染，導致減產和品質下降。其中由禾谷多黏菌傳播的土傳花葉類病毒病分布最廣、種類最多、危害最嚴重。在我國，土傳花葉類病毒病自20世紀70年代發現以來，一直是我國河南、江蘇、安徽、山東等冬小麥種植區常發的重要病害之一，已成為影響我國小麥高產優質的重要制約因素之一。估計，毎年土傳病毒病發病面積超過3000萬畝，減產150萬噸以上。病害為害嚴重，防治困難的原因，其ー是因為土傳病毒是由土壌中的禾谷多黏菌傳播，而禾谷多黏菌產生的休眠孢子具有極強的抗逆性，難以用化學方法防治。輪作、推遲栽培等農事操作防治效果并不理想。目前防治該病害的主要措施是種植抗病品種。其ニ是引起小麥黃花葉病害的病原物種類很多。針對不同地區的病毒株系，品種的抗病性表現差異很大，缺乏廣譜抗病品種， 并且部分重病區抗病品種資源嚴重缺乏。其三是不斷出現新的病毒和致病株系導致抗病品種的抗性喪失。
發明內容
本發明要解決上述現有技術的缺點，提供ー種高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段及應用，是一段激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段的核苷酸序列， 從根本上解決生產中的小麥黃花葉病毒病的危害，利用本發明提供的這段特異的核苷酸序列片段，可以高效的激發不同小麥品種的抗病能力，即表達本序列片段的小麥植株可有效的抵抗病毒的侵染。本發明采用了以下的技術方案這種高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段，具有SEQ ID NO: I所述的核苷酸序列。利用上述的高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段，將上述核苷酸序列連接到真核表達啟動子下游后進行常規的外源基因在小麥體內表達，表達本序列片段的小麥植株在有效抵抗病毒侵染方面的應用。本發明有益的效果是利用一段來源于小麥黃花葉病毒保守序列的核苷酸片段， 激發小麥的抗病性。由于此段序列是病毒復制所必須的復制酶基因片段，具有高度保守性及進化穩定性，因而，利用此片段激發的小麥抗病性具有廣譜抗病性和長期穩定性。
圖I載體pUib_35S示意圖。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明本發明提供了一段反義小麥黃花葉病毒復制酶基因片段，此片段在小麥細胞內表達后可引起持續、高效的抗小麥黃花葉病毒病的特性。本發明包括此段反義小麥黃花葉病毒復制酶基因的核苷酸序列，此段核苷酸鏈的同源性分析以及此段反義RNA序列的DNA克隆和表達載體構建。其中，所采用的病毒來源是江蘇省揚州市里下河研究所感染小麥黃花葉病毒的小麥葉片，提取感病葉片總RNA后，利用此片段相應正義RNA鏈上特定序列擴增獲得cDNA片段，利用相應的酶切位點將正義RNA鏈上部分復制酶基因反向插入表達載體中， 使得表達后可產生反義RNA片段，此片段經驗證可激發小麥高抗黃花葉病毒病的特性。此基因片段可推廣應用到其它抗小麥黃花葉病毒病的種質創建。一、序列的獲得取自感染小麥黃花葉病毒揚州分離物的小麥葉片約O. I克，利用Trizol從樣品組織中提取總RNA(參照Invitrogen公司說明)，以此總RNA中小麥黃花葉病毒(WYMV)基因組RNA為模板，進行逆轉錄及聚合酶鏈式反應。具體方法如下根據本實驗之前報道的 WYMV揚州分離物RNAl基因組全序列(AJ131981)設計引物FcWYV B5，(nts5284_5302) 5’-CGGATCCATGATCAGAATGTTG GAAG-3’和FcWYV B3’(nts 6495-6475) :5’_CGGATCCTTAGAGC TCAATGCTGCTATC-3’，并利用下游引物，FcWYV B3及所獲得的總RNA在42°C恒溫下進行逆轉錄反應，逆轉錄酶為Promega公司的SuperScriptII,反應體系如下5XRT Buffer 2 μ L,
2.5mmol/L dNTP 2μ L,0. lmol/L DTT I μ L，RNA酶抑制劑 0. 2 μ L，逆轉錄酶 0. 5 μ L，反應總體積為10 μ L。以逆轉錄所獲得的單鏈DNA片段為模板，FcWYV B5和FcWYV B3偉引物進行 PCR反應。反應體系如下IOx卩0 反應緩沖液5 4 1^，(1見13(2_01/1)5 4 1^ 0^￥ B5 I μ L， FcffYV Β3 I μ L，合成的cDNA 2 μ L, KOD (Τ0Υ0ΒΑ公司)酶I μ L，無菌水補足至50 μ L。反應條件為94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，68 °C延伸2分鐘，30個循環， 68°C延伸10分鐘。目的PCR產物大小約I. 2Kb，PCR產物莖Qiagen凝膠純化試劑盒純化后，利用TOYOBA T-Blunt載體進行PCR片段的克隆，反應條件如下，IOX ligation Buffer 2 μ L，T-Blunt I μ L, PCR 回收片段 10 μ L, PromegaT4_Ligase I μ L,無菌水補足至 20 μ L, 混勻后4V反應16小時。反應完畢后，取10 μ L反應液加入含有100 μ L大腸桿菌感受態的離心管中，輕輕混勻冰上放置25分鐘,42°C熱激90秒,立即放置冰上2-3分鐘，向離心管中加入LB培養基800 μ L，37°C孵育I小時后，取300 μ L培養液涂布于含有lOOmmol/L氨芐青霉素，lmmol/L IPTGjP 10mg/L的固體LB培養基上，37°C倒置培養16小時。之后選擇白色菌落送上海Invitrogen公司測序。含有插入序列的克隆命名為T_Nibl。二、序列的應用方法利用分子生物學實驗技術將獲得核苷酸片段反向連接到Ubi或35S啟動子下游， 進行常規的植物表達載體構建后進行外源基因在小麥體內的表達，表達的反向核苷酸序列即可高效激發小麥的抗WYMV特性。浙江省農業科學院病毒學與生物技術所根據已報道的小麥黃花葉病毒中國揚州分離物RNAl基因組全序列(AJ131981)設計引物FcffYV B5，(nts5284_5302) 5’ -CGGATCCATGATCAGAATGTTG GAAG-3’ 和 FcffYV B3’ (nts 6495-6475) :5’ -CGGATCCTTA GAGCTCAATGCTGCTATC-3’，該對引物特異性的擴增WYMV復制酶(NIb)基因3’ -端2/3全長序列，擴增的目的序列長1212個核苷酸。載體pUib-35S (圖I載體pUib-35S示意圖(BamH I為唯一的克隆位點)及反向插入Nib8基因的核苷酸序列)用BamH I酶切后平端化，連接平端化的PCR擴增產物，獲得插入有WYMV部分復制酶基因序列的克隆。根據載體pUib-35S的BamHI單克隆位點上游的Ubi-I intron序列設計測序引物Ubi-I 5， 5’ -CGCTATTTATTTGCTTGGTACGG-3’，通過序列測定確定外源基因的插入方向，最終獲得反向插入WYMV部分復制酶基因序列的克隆WYMV-Nib8，采用組成型啟動子Ubiquitin構建了用于小麥轉化的高效表達載體PUbiNib8.之后利用基因槍共轉化法將pUbiNib8載體導入受體品種揚麥158 (高度感病品種)，轉基因植物田間接種實驗表明，轉入此序列的揚麥158可 100%提高抗WYMV的抗性田間抗病性分析也證實此免疫此序列可有效激發小麥品種的抗 WYMV特性。SEQ ID NO IATGATCAGAA TGTTGGAAGA CGCCGGCCTA ACTCAAGGCG ACGTGAGGAC ACCCCAACAG GTTGTTTCAG ACATGCAGTGGAACACTTCC GCCGGACCAA GCTACCAGGG CAAGAAAAGA GACGTTTGCG CACATCTCAG CGAGCAGGAA GTTCTACACCTTGCAGAAAC GTCGCGACAG CAGTTTCTAG CCTGCAATTC CATCGGCATT TGGAACGGAT CGCTCAAAGC AGAGCTTAGGACGATTGAGA AAGTGGAAGC TGAGAAAACC AGAGTTTTCA CGGCTTCGCC AATCACGAGT CTATTCGCCA TGAAGTTCTACGTTGACGAT TTCAACAAGA AGTTCTATGC GACAAACCTG AAAGCCCCAC ACACGGTAGG AATTAACAAA TTTAGCAGAGGCTGGGAAAT GCTCCACGAC AAGCTCAACC GCCCAGGTTG GCTTCACGGC AGTGGCGATG GGTCACGATT TGATAGTTCAATTGACCCTT TCTTCTTCGA CATAATCAAG GAGATTCGAA AGCACTTTCT ACCAGTTGAG CACCATCGCG CAATCGACCTAATATACGAC GAGATTCTCA ACACCAACAT TTGTTTGGCA AATGGCATGG TGATTCGAAA GAACGTTGGG AATAACAGCGGGCAGCCAAG CACGGTCGTA GACAACACAC TTGTTCTCAT GGTCTCTTTT CTCTACGCTT ACATTCATAA AACCGGAGACCATATGCTCA AGAAACTCAA CGACAGATTT GTTTTCGTCT GCAATGGTGA CGACAACAAA TTTGCCATTT CCCCAGAATTCGACGCCGAG TTCGGTCACG ACTTTTCACC GGAGCTCACA GAGCTAGGTT TGACGTACGA GTTTGACGAC ATAACAGATGACATGTGTGC AAACCCCTAC ATGTCCCTGA CCATGGTCCG CACTCCCTTT GGAATTGGGT TCTCTTTGCC CGTGGAACGCATTGTAGCAA TAATGCAGTG GGCTAAGAAG GGCGGCGTTC TGCACTCTTA CTTGGCAGGA ATCTCAGCCA TTTACGAAAGCTTCAACACA CCAAAGTTGT TCAAATCAGT CTATGCGTAT TTGTTATGGC TGACAGAGGA ACACGGCTCT GACATCCTAGCTGCAATGAC CGGAACAGAG ACAGCTCTCC CAATTCCTTC CATGCTCGAT GTGTACCGCCTCCACTATGG TGATAGCAGCATTGAGCTCC AA除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。
權利要求
1.一種高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段，其特征是具有SEQ ID NO: I 所述的核苷酸序列。
2.一種利用如權利要求I所述的高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段的應用，其特征在于將上述核苷酸序列連接到真核表達啟動子下游后進行常規的外源基因在小麥體內表達，表達本序列片段的小麥植株在有效抵抗病毒侵染方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段及應用，是一段激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段的核苷酸序列，這種高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段，具有SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。利用上述的高效激發小麥抗黃花葉病毒病的復制酶基因片段，將上述核苷酸序列連接到真核表達啟動子下游后進行常規的外源基因在小麥體內表達，表達本序列片段的小麥植株在有效抵抗病毒侵染方面的應用。本發明有益的效果利用來源于小麥黃花葉病毒保守序列的核苷酸片段，激發小麥的抗病性。由于是病毒復制所必須的復制酶基因片段，有高度保守性及穩定性，利用此片段激發的小麥抗病性具有廣譜抗病性和長期穩定性。
文檔編號C12N15/54GK102604972SQ20111042023
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者吳宏亞, 孫麗英, 張伯橋, 張曉祥, 徐惠君, 程順和, 陳劍平, 陳明, 陳炯, 馬有志 申請人:中國農業科學院作物科學研究所, 江蘇里下河地區農業科學研究所, 浙江省農業科學院