專利名稱：用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑及其應用。
背景技術：
約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)是一種重要的乳桿菌，屬益生菌，它對動物益生功能主要體現在以下三方面1.調控動物天然防御系統及免疫機能作用；2.預防動物特異性皮炎作用；3.排他性競爭作用。但約氏乳桿菌對生長條件要求苛刻，在生產制備、 貯藏期間極易失活。真空冷凍干燥技術是保存發酵益生菌最有效的方法之一，但真空凍干過程中，由于細胞內還有大量的水分，低溫凍存細胞時，胞內的水分以兩種方式固化一種是形成冰晶，另一種是形成無定型的玻璃化狀態。當以冰晶的形式固化時，水的體積增大及冰晶的機械力使細胞內部電解質濃度增高，PH改變，蛋白質和酶變性，從而引起細胞內部結構的破壞，最終使細胞死亡；而在玻璃化的固化過程中，水分子沒有發生重排，不會產生結構和體積的變化，因而不會由于機械或溶液效應造成組織和細胞傷害，復蘇后的細胞仍具有活力。 胞內水分子固化處于冰晶和玻璃態動態平衡。因此，在細胞凍干技術的關鍵就是要使水分盡可能多的以玻璃態的形式固化，同時降低細胞內的水分，減少冰晶的形成。在益生菌菌粉真空干燥過程中加入適當的保護劑，有利于微生物抵御冷凍的機械傷害以及長期存放，已成為保存益生菌的必然要求。根據保護劑所起作用的不同可分為兩種，滲透性保護劑和非滲透性保護劑。滲透性保護劑是指一些分子量較小的有機物，易于穿透細胞膜與胞內水分子結合，從而降低細胞冰點，同時提高細胞膜對水分子的通透性。凍存時，可促使胞內水分滲出，從而減少胞內冰晶的形成。非滲透性保護劑是一些易溶于水的大分子物質，不能滲透到胞內，但可降低胞外含水量，減小胞外冰晶的形成。兩種保護劑的作用方式不同，在冷凍過程中配合使用，可有效提高凍干菌粉的存活率。在凍干過程中還常常加入抗氧化劑，以防止氧化作用對細胞的傷害，保持細胞活性并提高細胞的穩定性。目前，有關凍干保護劑的研究主要集中在醫學醫藥領域，應用于生產微生物飼料添加劑活菌制劑的凍干保護劑的研究不多且結果差異大，存在活菌數不高的缺點。有些保護劑中有山梨醇類物質，保護效果有一定提高，但山梨醇類物質的成本較高，限制了它在農業生產中的應用且目前無針對約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑。
發明內容
本發明提供一種用于約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)真空冷凍干燥的保護劑，減小冷凍干燥對菌體的損傷，提高凍干后產物活菌數及利用效率，可制備出高活性的約氏乳桿菌凍干菌粉。本發明的另一目的是提供該用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑在制備約氏乳桿菌凍干菌粉中的應用。
本發明的目的是通過如下技術方案實現的本發明提供一種用于約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)真空冷凍干燥的保護劑，每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳0. 25-0. 5g、海藻糖 0. 25-0. 5g、可溶性淀粉 0. 25-lg、谷氨酸鈉 0. 25_lg、甘油 0. 25-0. 5g。為更好的達到本發明的發明效果每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=1 1 1 1 1。為更好的達到本發明的發明效果每克濕菌體或濕菌泥也可使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=2 1 2 4 1。為更好的達到本發明的發明效果每克濕菌體或濕菌泥也可使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=2:2:4:1:2。本發明的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑可應用于制備約氏乳桿菌凍干菌粉。進一步，制備約氏乳桿菌凍干菌粉的過程如下(1)約氏乳桿菌種子基培養；(2) 高密度發酵；(3)發酵菌泥的收集；(4)凍干菌粉的制備。更進一步，制備約氏乳桿菌凍干菌粉的過程如下(1)約氏乳桿菌種子基培養從平板上挑取約氏乳桿菌的單菌落至50mL的MRS培養基中，37度恒溫培養18h，然后以5 %的接種量轉接至500mL的MRS培養基中，繼續37度下靜止培養18h，即得到種子基；(2)高密度發酵高密度發酵的參數設置如下氨水調節維持PH值5. 0 ；轉速50轉/分鐘；溫度37 度；罐壓保持0. 05MPa ；發酵時間12小時；(3)發酵菌泥的收集發酵液4000g離心10分鐘， 棄去上清；用生理鹽水將菌體重懸；4000g離心10分鐘，棄去上清；(4)凍干菌粉的制備向制備的菌泥中加入5倍體積的保護劑，混勻，平衡30分鐘；于-80度預凍3小時；在真空冷凍干燥機中凍干30-36小時，凍干參數設置如下真空度0. IMba-O. 2Mba ；冷阱溫度為-50 度至-55度，即得。有益效果本發明為乳酸菌的保藏，尤其是約氏乳桿菌的保藏，提供了一個新的保護劑組方； 該保護劑中無山梨醇類物質，成本較低；該保護劑可對約氏乳桿菌在真空冷凍干燥過程中起有效保護作用，保護率高，生產出的活菌得率在IO9以上，有利于乳酸菌微生物飼料添加劑利用效率的提高。通過下列實施例將更具體的說明本發明，但是應理解所述實施例僅是為了說明本發明，而不是以任何方式限制本發明的范圍。
具體實施例方式實施例1-實施例18(1)種子基的制備挑取約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)的單菌落至50mL的MRS培養基(蛋白胨10克，肉膏10克，酵母提取物5克，磷酸氫二鉀2克，檸檬酸二銨2克，乙酸鈉5克，葡萄糖20克，土溫lmL，七水硫酸鎂0. 58克，四水硫酸錳0. 25克，蒸餾水1L，pH6. 2-6. 4)中， 37度恒溫培養18小時，然后5%的接種量轉接至500mL的MRS培養基中，繼續37度下靜止培養18小時，值OD6tltlnm為5. 0即得到種子基。
(2)高密度發酵1 %的接種量將種子基接入5L的發酵罐中，發酵過程中以氮氣保持罐壓為 0. 05MPa，轉速為50轉/分鐘，溫度為37度，流加氨水保持pH為5. 0 ；培養4小時后開始流加葡萄糖繼續培養8小時。(3)發酵菌泥的收集及(4)凍干菌粉的制備發酵液于4度，4000g離心10分鐘收集菌體；棄去上清，沉淀用無菌生理鹽水重懸，按上述條件再次離心，棄去上清，分別用5倍體積37度預熱各種配比的本發明的保護劑 (見表1)重懸菌體，攪拌平衡30分鐘，置于-80度冰箱預凍3小時，置于真空冷凍干燥機中。凍干條件為真空度0. 2mba，冷阱溫度為-55度，凍干30小時，即得到約氏乳桿菌凍干粉。(5)存活率測定稱取1克干菌粉溶于9mL生理鹽水中，混勻；依次10倍稀釋至KTki ；每個稀釋度取100微升涂布MRS瓊脂培養基(蛋白胨10克，肉膏10克，酵母提取物5克，磷酸氫二鉀2 克，檸檬酸二銨2克，乙酸鈉5克，葡萄糖20克，土溫lmL，七水硫酸鎂0. 58克，四水硫酸錳 0. 25克，瓊脂15克，蒸餾水1L，pH6. 2-6. 4)，每個梯度做三個平行，37度培養18小時，采用平板菌落計數法，得出發酵液和凍干樣品中的活菌數，并計算乳酸菌的存活率(結果見表1)。表1保護劑配方設計及結果
權利要求
1.一種用于約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)真空冷凍干燥的保護劑，其特征在于每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳0. 25-0. 5g、海藻糖 0. 25-0. 5g、可溶性淀粉 0. 25-lg、谷氨酸鈉 0. 25_lg、甘油 0. 25-0. 5g。
2.如權1所述的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑，其特征在于每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油= 1:1:1:1:1。
3.如權1所述的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑，其特征在于每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=2 · 1 · 2 · 4 · 1 ο
4.如權1所述的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑，其特征在于每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=2 · 2 · 4 · 1 · 2 ο
5.如權1-4任一項所述的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑在制備約氏乳桿菌凍干菌粉中的應用。
6.如權5所述的應用，其特征在于制備約氏乳桿菌凍干菌粉的過程如下(1)約氏乳桿菌種子基培養；(2)高密度發酵；(3)發酵菌泥的收集；(4)凍干菌粉的制備。
7.如權6所述的應用，其特征在于制備約氏乳桿菌凍干菌粉的過程如下(1)約氏乳桿菌種子基培養從平板上挑取約氏乳桿菌的單菌落至50mL的MRS培養基中，37度恒溫培養18h，然后以5%的接種量轉接至500mL的MRS培養基中，繼續37度下靜止培養18h，即得到種子基；( 高密度發酵高密度發酵的參數設置如下氨水調節維持 PH值5. 0 ；轉速50轉/分鐘；溫度37度；罐壓保持0. 05MPa ；發酵時間12小時；(3)發酵菌泥的收集發酵液4000g離心10分鐘，棄去上清；用生理鹽水將菌體重懸；4000g離心10分鐘，棄去上清；(4)凍干菌粉的制備向制備的菌泥中加入5倍體積的保護劑，混勻，平衡30 分鐘；于-80度預凍3小時；在真空冷凍干燥機中凍干30-36小時，凍干參數設置如下真空度0. IMba-O. 2Mba ；冷阱溫度為-50度至-55度，即得。全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑及其應用。本發明的保護劑中無山梨醇類物質，成本較低；該保護劑可對約氏乳桿菌在真空冷凍干燥過程中提供有效保護，保護率高，生產出的活菌得率在109以上，有利于乳酸菌微生物飼料添加劑利用效率的提高。
文檔編號C12R1/225GK102453681SQ201110419979
公開日2012年5月16日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者孫曉雯, 張軍, 汪攀, 王安如, 閆軼潔 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 湖南大北農農業科技有限公司, 漳州大北農農牧科技有限公司