專利名稱：β-1,4-內切殼聚糖酶(Aus CsnB)基因的克隆及序列分析的制作方法
技術領域：
本發明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一種新型內切殼聚糖酶及其基因(Aus csnB)完整mRNA和DNA序列的克隆及分析，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
殼聚糖(chitosan)由自然界廣泛存在的幾丁質(chitin)經過脫乙酰作用得到或天然存在于接合菌、半知菌等真菌的細胞壁中，在醫藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫學工程等諸多領域有重要應用。殼聚糖酶是專一性降解殼聚糖的糖苷水解酶，可催化水解至少含有一個GlcN基團糖苷和水解部分乙酰化殼聚糖，但不能降解幾丁質(完全乙酰化)。殼聚糖酶水解殼聚糖的產物殼寡糖相比殼聚糖具有水溶性好，易吸收的優點，并具有獨特的生理活性與功能，在食品、醫藥、農業、化妝品行業有廣泛應用，因而殼聚糖酶的研究對殼寡糖的生產應用具有
重要意義。目前提高真菌產酶能力，更多是通過克隆真菌殼聚糖酶基因，并試圖獲得高效表達的基因工程菌為目標。現已有大量關于內切殼聚糖酶基因克隆與表達的報道，但很少有關于宇佐美曲霉殼聚糖酶基因的報道。本發明為該基因的異源高效表達和產業化生產奠定了理論基礎。
發明內容
本發明的目的是提供一種新型內切殼聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆及分析，為該基因的異源高效表達和產業化生產奠定理論基礎。生物信息學分析表明該基因所編碼的內切殼聚糖酶屬于A.USamii EOOl中發現的第2種75家族的內切殼聚糖酶，其相應的基因命名為Aus csnB。A. usamii EOOl菌株由江南大學篩選和保藏，已于2005年在《食品與發酵工業》雜志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開，本發明人承諾該菌株在20年內向公眾發放。本發明的技術方案一種源自A.usamii EOOl的新型內切殼聚糖酶，其基因(Aus csnB)完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。獲取完整mRNA 和DNA序列的流程如圖1所示。所述的由完整mRNA推導的Aus CsnB氨基酸序列為SEQ ID NO :3。所述的Aus csnB完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法(I)Aus csnB 3'端mRNA序列的克隆首先對糖苷水解酶75家族的Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus NIH2624 禾口 Aspergillus fumigatus Af293 殼聚糖醇的氛基酸序列進行同源比對，設計兩條簡并引物CsnB-Fl和CsnB-F2，以A. usamii EOOl總RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor I^rimer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以合成的cDNA第一條鏈為模板，M13ft~imetM4和CsnB-Fl為引物進行第一輪PCR擴增；再以第一輪PCR擴增產物為模板，M13Primer M4和CsnB-F2為引物進行第二輪PCR擴增；割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體連接，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus csnB 3'端 mRNA序列。引物CsnB-Fl和CsnB_F2序列如下CsnB-Fl 5' -ATGGATGT(T/C)GACTGTGATG-3‘CsnB-F2 5‘ -CTACATCACCAACTTCA(G/C/A)CAC-3‘(2)Aus csnB 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus csnB 3'端mRNA序列，設計兩條擴增5'端cDNA序列的反向引物CsnB-Rl和CsnB-R2 ；以反轉錄合成的cDNA 第一條鏈為模板，5' RACE Outer I^rimer和CsnB-Rl為引物進行第一輪PCR擴增；再以 5' RACE Inner I^rimet和CsnB-R2為引物進行第二輪PCR擴增；割膠回收目的條帶并與 pUCm-T載體連接，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus csnB 5'端 mRNA序列。引物CsnB-Rl和CsnB_R2序列如下CsnB-Rl 5‘ -GTGGTCTGAGAGGGTACGCTG-3‘CsnB-R2 5‘ -GTGCTGAAGTTGGTGATGTAG-3‘(3)Aus csnB編碼區DNA序列的克隆基于上述得到的Aus csnB 5'禾Π3'端mRNA 序列，設計一對引物CsnB-F和CsnB-R。以A. usamii EOOl的基因組DNA為模板，CsnB-F禾口 CsnB-R為引物進行PCR，割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體連接，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus csnB編碼區的DNA序列；將DNA序列與mRNA用DNAMAN6. 0 進行序列比對，得出Aus CsnB內含子序列。引物CsnB-F和CsnB-R序列如下CsnB-F 5' -GAATTCCAGTCCGTCGATGGCTCC-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點；CsnB-R 5' -GCGGCCGCTCACTCATCGTCCTCGTCA-3 ‘，含 Not I 酶切位點；(4) Aus csnB 5 ‘端調控序列的克隆利用我們前期報道的T載體介導-PCR方法(江南大學.一種T載體介導的測定5'端側翼未知序列的方法中國， CN201010550843. 0 [P] · 2011-8-3.)，用 XbaI 和 Pst I 酶切 A. usamii EOOl 基因組DNA，純化的酶切產物用Ex Taq酶補齊和3 ‘端加A，與pUCm_T連接；以T載體連接物為模板，T載體上游5 ‘端引物T-PrimerF和CsnB-R3為引物進行第一輪PCR ；再以第一輪PCR擴增產物為模板，T-PrimerF和CsnB-R4為引物第二輪PCR，經過兩輪PCR，得到Aus csnB 5'端調控序列。CsnB-R3與CsnB-R4引物序列如下CsnB-R3 5' -GTACAACAGCCCGAGTAAC-3‘
CsnB-R4 5‘ -GAGAAGGTGCCAAGTGAAG-3‘(5) Aus csnB 3 ‘端調控序列的克隆利用我們前期報道的T載體介導-PCR方法(江南大學一種T載體介導的測定3'端側翼未知序列的方法中國， CN201010550843.0[P]. 2011-8-3)，根據測序得到的 Aus csnB 3'端 mRNA 序列，設計兩條擴增3'端調控序列的正向引物CsnB-F3和CsnB_F4，用SalI和SacI酶切A. usamii EOOl 基因組DNA，純化的酶切產物用Ex Taq酶補齊和3 ‘端加A，與pUCm_T連接；以T載體連接物為模板，T載體下游3'端引物T-PrimerR和CsnB-F3為引物進行第一輪PCR;再以第一輪PCR擴增產物為模板，T-PrimerR和CsnB_F4為引物第二輪PCR，經過兩輪PCR，得到Aus csnB 3'端調控序列。CsnB-F3與CsnB-F4引物序列如下CsnB-F3 5' -CAGCGTACCCTCTCAGAC-3‘CsnB-F4 5' -TTGCGATAGTGGGAAGTGC-3‘(6) Aus csnB的生物信息學分析將Aus csnB的5 ‘端cDNA與3 ‘端cDNA進行序列拼接，得到轉錄起始位點至PolyA的cDNA序列，在NCBI上進行開放閱讀框架分析 (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)，進而推測出 CsnB 的氨基酸序列，然后進行信號肽預測；將Aus CsnB的編碼區DNA序列與其兩側序列進行拼接，獲得完整的DNA 序列，并對其5 ‘端調控序列和3 ‘端調控序列的功能進行預測。本發明的有益效果本發明提供了一種來源于A.USamii EOOl的新型內切殼聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆及分析，為該基因的異源高效表達和產業化生產奠定了理論基礎。生物信息學分析表明該基因所編碼的內切殼聚糖酶屬于A.USamii EOOl中發現的第2種75家族的內切殼聚糖酶，其相應的基因命名為Aus csnB.
圖1 獲取A. usamii EOOl CsnB基因完整mRNA和DNA序列的流程圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。實施例IAus csnB 3'端mRNA序列的克隆首先對糖苷水解酶 75 家族的 Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus NIH2624和Aspergi 1 Ius fumigatus Af293殼聚糖酶的氨基酸序列進行同源比對，設計兩條簡并引物 CsnB-Fl 和 CsnB-F2，以 A.usamii EOOl 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13PrimerM4和CsnB-Fl為引物進行第一輪PCR 擴增，其反應條件為94°C 2min，30 個循環(94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；以 M13Primer M4和CsnB_F2為引物進行第二輪PCR擴增，其反應條件為94°C 2min，30個循環 (94 °C 30s,51°C 30s, 72 °C 40s), 72 °C IOmin ；將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析， 回收目的條帶并與PUCm-T連接，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。實施例2Aus csnB 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus csnB 3'端mRNA序列，設計兩條擴增5 ‘端cDNA序列的反向引物CsnB-Rl和CsnB-R2，按照TaKaRa生產的5' -Full RACE Kit中的說明書進行 5' -RACE:以5' RACE Outer I^rimer和CsnB-Rl為引物進行第一輪PCR，其反應條件為 94 0C 3min，30 個循環(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ；以第一輪的 PCR 擴增產物為模板，5' RACE Inner I^rimer和CsnB-R2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為 940C 3min，30 個循環(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 50s)，72°C IOmin ；將兩輪 PCR 產物用瓊 脂糖凝膠電泳分析，將目的條帶割膠回收并與PUCm-T連接，轉化JM109，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定。實施例3Aus csnB編碼區DNA序列的克隆基于上述得到的Aus CsnB 5'和3'端mRNA序列，設計一對引物CsnB-F和 CsnB-R ；以A. usamii E001基因組DNA為模板，CsnB-F和CsnB-R為引物進行PCR，其反應條件為:94°C 4min，30 個循環(94°C 30s，51°C 30s, 72°C 90s)，72°C IOmin0 將 PCR 產物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得出Aus csnB編碼區DNA序列，將DNA與mRNA序列用DNAMAN 6. 0進行序列比對，得出Aus csnB內含子序列。實施例4Aus csnB 5'端調控序列的克隆利用我們前期報道的T載體介導-PCR方法，用)(ba I和I^st I兩種限制性內切酶酶切A. usamii EOOl基因組DNA，純化的酶切產物用Ex Taq酶補齊和3 ‘端加A，與pUCm-T 連接；以T載體連接物為模板，T載體上游5'端引物T-PrimerF和CsnB-R3為引物進行第一輪 PCR，其反應條件為94°C 4min, 30 個循環(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 40s)，72°C IOmin ； 再以第一輪PCR擴增產物為模板，T-PrimerF和CsnB-R4為引物第二輪PCR，其反應條件為 940C 4min，30 個循環(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 30s)，72°C lOmin，將兩輪 PCR 產物用瓊 脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接，轉化JM109，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得出Aus csnB 5'端調控序列。實施例5Aus csnB 3'端轉錄終止區序列的克隆利用我們前期報道的T載體介導-PCR方法，用MlI和McI兩種限制性內切酶酶切A. usamii EOOl基因組DNA，純化的酶切產物用Ex Taq酶補齊和3'端加A，與pUCm-T連接；以T載體連接物為模板，T載體下游3'端引物T-PrimerR和CsnB-F3為引物進行第一輪 PCR，其反應條件為94°C 4min，30 個循環(94 °C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 50s), 72 °C IOmin ； 再以第一輪PCR擴增產物為模板，T-PrimerR和CsnB-F4為引物第二輪PCR，其反應條件為 94°C 4min，30 個循環(94°C 30s，53°C 30s，72°C 40s)，72°C IOmin ；將兩輪 PCR 產物用瓊 脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接，轉化JM109，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得出Aus csnB 3'端調控序列。實施例6Aus csnB生物信息學分析將Aus csnB的5'端與3'端cDNA序列進行拼接，得到轉錄起始位點至PolyA的 cDNA 序列，在 NCBI 上進行開放閱讀框架分析(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)，進而推測出Aus CsnB的氨基酸序列，然后進行信號肽預測；將DNA序列與兩側調控序列進行拼接，獲得完整的DNA序列，然后進行啟動子區域預測(http://WWW. fruitfly. org/seq_tools/promoter. ht)禾口 PolyA 力口尾信號預測(http //genes, mit. edu/GENSCAN. html)。
權利要求
1.一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、歸屬于糖苷水解酶第75家族的新型內切殼聚糖酶基因，其完整mRNA和DNA的序列分別對應于序列表中的SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2。
2.如權利要求1所述的新型內切殼聚糖酶(AusCsnB)，其氨基酸序列為SEQ ID NO3。
3.Aus csnB完整mRNA和DNA序列的獲取方法(1)AuscsnB 3'端mRNA序列的克隆首先對屬于糖苷水解酶75家族的Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus NIH2624 禾口 Aspergillus fumigatus Af293 殼聚糖醇的氛基酸序列進行同源比對，設計兩條簡并引物CsnB-Fl和CsnB-F2，以A. usamii EOOl總RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4 和CsnB-Fl為引物進行第一輪PCR擴增，其反應條件為94°C 2min，30個循環(94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ；以 M13Primer M4 和 CsnB_F2 為引物進行第二輪 PCR 擴增，其反應條件為94°C 2min，30 個循環(94°C 30s,51°C 30s, 72 °C 40s), 72 °C IOmin ；將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Aus csnB 3'端mRNA序列；引物CsnB-Fl和CsnB-F2 序列如下CsnB-F1:5' -ATGGATGT(T/C)GACTGTGATG-3‘CsnB-F2 5‘ -CTACATCACCAACTTCA(G/C/A)CAC-3‘(2)Aus CsnB 5 ‘端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus csnB 3 ‘端mRNA序列，設計兩條反向引物CsnB-Rl和CsnB-R2，按照TaKaRa生產的5' -Full RACE Kit中的說明書進行5' -RACE:以5' RACE Outer Primer和CsnB-Rl為引物進行第一輪PCR，其反應條件為94°C 3min，30 個循環(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ；以第一輪 PCR 擴增產物為模板，5' RACE hner I^rimer和CsnB-R2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為 940C 3min，30 個循環(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；將兩輪 PCR 產物用瓊 脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接，轉化JM109，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得到Aus csnB 5'端mRNA序列；引物CsnB-Rl和CsnB_R2序列如下CsnB-Rl 5 ‘ -GTGGTCTGAGAGGGTACGCTG-3‘CsnB-R2 5‘ -GTGCTGAAGTTGGTGATGTAG-3‘(3)Aus CsnB編碼區DNA序列的克隆基于上述得到的Aus csnB 5'和3'端mRNA序列，設計一對引物CsnB-F和CsnB-R ；以A. usamii EOOl基因組DNA為模板，CsnB-F和CsnB-R 為引物進行PCR，其反應條件為94°C %iin，30個循環(94 °C 30s, 51 °C 30s, 72 °C 90s), 72°C lOmin，將PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接， 轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得出Aus csnB編碼區DNA序列，將DNA與 mRNA序列用DNAMAN 6. 0進行序列比對，得出Aus csnB內含子序列；(4)AuscsnB 5'端調控序列的克隆利用我們前期報道的T載體介導-PCR 方法(江南大學一種T載體介導的測定5 ‘端側翼未知序列的方法中國， CN201010550843.0[P]. 2011-8-3)，用 Xba I 和 Pst I 酶切 A. usamii E001 基因組DNA，純化的酶切產物用Ex Taq酶補齊和3 ‘端加A，與pUCm_T連接；以T載體連接物為模板，T載體上游5'端引物T-PrimerF和CsnB-R3為引物進行第一輪PCR，其反應條件為94°C 4min,-30 個循環(94°C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 40s), 72 °C IOmin ；再以第一輪 PCR 擴增產物為模板， T-PrimerF和CsnB_R4為引物第二輪PCR，其反應條件為94°C 4min,30個循環(94°C 30s， 53 °C 30s, 72 °C 30s), 72 °C lOmin，將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接，轉化JM109，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得出Aus csnB 5'端調控序列CsnB-R3與CsnB_R4引物序列如下 CsnB-R3 5‘ -GTACAACAGCCCGAGTAAC-3‘ CsnB-R4 5‘ -GAGAAGGTGCCAAGTGAAG-3‘(5)Aus csnB 3'端轉錄終止區序列的克隆利用我們前期報道的T載體介導-PCR方法(江南大學一種T載體介導的測定3'端側翼未知序列的方法中國， CN201010550843.0[P]. 2011-8-3)，根據測序得到的A.usamii EOOl新型內切殼聚糖酶基因 3'端cDNA序列，設計兩條擴增3'端調控序列的正向引物CsnB-F3和CsnB-F4，用Ml I 和Me I酶切A. usamii EOOl基因組DNA，純化的酶切產物用Ex Taq酶補齊和3'端加A， 與pUCm-T連接；以T載體連接物為模板，T載體下游3 ‘端引物T-PrimerR和CsnB-F3為引物進行第一輪PCR，其反應條件為94°C %iin，30個循環(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 50s), 72°C IOmin 再以第一輪PCR擴增產物為模板，T-PrimerR和CsnB_F4為引物第二輪PCR，其反應條件為94°C 4min，30 個循環(94°C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 40s), 72 °C IOmin ；將兩輪 PCR 產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接，轉化JM109，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得出Aus CsnB 3'端調控序列；CsnB-F3與CsnB-F4引物序列如下CsnB-F3 5‘ -CAGCGTACCCTCTCAGAC-3‘ CsnB-F4 5‘ -TTGCGATAGTGGGAAGTGC-3‘(6)AuscsnB生物信息學分析將Aus csnB的5'端與3'端cDNA序列進行拼接，得到轉錄起始位點至PolyA的cDNA序列，在NCBI上進行開放閱讀框架分析(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorfhtml)，進而推測出CsnB的氨基酸序列，然后進行信號肽預測；將DNA序列與兩側調控序列進行拼接，獲得完整的DNA序列，然后進行啟動子區域預測 (http //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html)禾口 PolyA 力口尾信號預測(http:// genes, mit. edu/GENSCAN. html)。
全文摘要
本發明提出了一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的新型內切殼聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。生物信息學分析表明該內切殼聚糖酶是在A.usamii E001中發現的第二種殼聚糖酶，所以命名為Aus CsnB，其氨基酸序列為SEQ ID NO3，相應的基因命名為Aus csnB。這為該基因的異源表達和工業化生產奠定了理論基礎，有較大的工業化生產和應用潛力及經濟價值，也為其它內切殼聚糖酶的研究奠定了理論基礎。
文檔編號C12N9/42GK102492709SQ201110410628
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者吳靜, 曾研, 鄔敏辰, 雷艷麗, 龔香藝 申請人:江南大學