一種快速區分柑橘品種的引物和方法

專利名稱：一種快速區分柑橘品種的引物和方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學分子標記領域，具體地說涉及一種快速區分柑橘品種的引物和方法。
背景技術：
柑橘屬于蕓香科果樹，包括橘、柑、柚、橙、檸檬等，在世界上主要分布在北緯35° 以南的區域。柑橘屬植物一直是我國以及世界主栽的果樹樹種之一。柑橘屬品種資源十分豐富。因此，建立柑橘屬品種快速可靠的鑒定技術體系對于苗木早期鑒定、品種權利保護、 生產中品種的區分以及研究柑橘屬種質資源的親緣關系和遺傳多樣性等具有重要的實際意義。到目前為止，傳統單一的形態學品種鑒定方法由于受環境的影響難以有效區分或鑒別眾多的品種；另一方面，許多柑橘屬育種親本越來越集中在少數優良品種或品系上，使得所選育的新品種在更多的性狀上更加相似，而難以區分。如何有效的鑒定科研和生產中品種，就成為一個常常遇到，而又非常重要的問題。迄今尚沒有利用DNA標記進行品種鑒定的快速與高效的措施，也無法形成進行品種鑒定時的依據與參考。因此，品種鑒定就缺乏目的性，非直觀，同時隨機性太強，工作效率低。為此，開發快速進行品種鑒定的新措施具有重要眉、ο
分子標記是隨著分子克隆和重組DNA技術的發展而產生的一類遺傳標記。近年來，分子標記技術已被廣泛用于蔬菜作物的種質鑒定和指紋分析。由于DNA分析技術不受環境、發育階段、取樣部位的影響，檢出的多態位點是無限的，結果具有高度的可靠性，且鑒別力強，重復性高。在常用的RAPD、RFLP, SSR、AFLP等分子標記技術中，RAPD(Rand0m Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)發展歷史長，是應用最早的DNA標記技術之一，它以快捷、簡便、不易受外界環境影響以及不需要預知基因組序列的特點與優勢， 已被廣泛應用于品種的分類研究、種質資源的遺傳基礎研究、基因連鎖標記、遺傳圖譜的構建等方面。
現有RAPD在蔬菜作物的種質鑒定中，多采用計算機軟件繪制數字化指紋圖譜，并結合統計學軟件進行聚類分析，但聚類分析的結果往往無法用于品種鑒別。中國專利“基于基因組RAPD分析的豇豆品種分子鑒定方法”(專利號ZL200510018593. 5)公開了基于RAPD 區分并判斷豇豆不同品種的方法，經過篩選得到23個引物，采用0-1指紋技術并構建出聚類樹。該專利采用引物較多，在品質鑒定時操作量非常大，不具備時效性，通過聚類樹不好判斷區分品種的引物，而且不夠直觀。發明內容
發明目的本發明的目的是提供一種快速區分柑橘品種的引物和方法，用于快速區分、鑒定柑橘品種。
技術方案為了實現上述目的，本發明的一種快速區分柑橘品種的引物包括
Y17 :5， -AGGGGTCTTGG-3，，
Y23 5，-GGACCCAACCG-3，，
Y28 5 ’ -GTGTGCCCCAT-3’，
Y40 5，-AGCGTCCTCCT-3，，
Y41 :5，-AGCGTCCTCCG-3，，
Y47 5，-ACGACCGACAG-3，，
Y54 5，-TGGTGGCGTTC-3，，
Y55 5' -ACCCCCGACTT-3’，
Y59 5，-ACCCCCGACTG-3，，
Y60 5，-ACCCCCGACTC-3，，
1S2 :5， -GGGTAACGCCA-3，，
1S3 :5， -GGGTAACGCCT-3，，
1S4 :5，-GGGTAACGCCT-3，，
5S2 5，-CCGCTACCGAA-3，，
5S5 5 ’ -CCGCTACCGAG-3’，
A5 :5， -GTCCACACGGT-3，；
由于RAPD擴增自身的特點，對隨機引物的設計顯得尤為重要。一般RAPD的引物為9 10個堿基，理論上，引物越短，模板序列兩端與引物互補的位點數量越多，擴增的PCR 多態性豐富；但是，引物較短，也會引起模板互補配對穩定性低的問題。本發明采用11堿基的引物，可提高RAPD反應的穩定性。
另外，引物的退火溫度也非常重要，因此本發明在設計若干隨機引物后要對引物進行嚴格的篩選。所述引物是通過設計的隨機引物經3次梯度PCR篩選出條帶清晰、PCR產物重復出現的引物。引物要選擇擴增性強、穩定性高、多態性好的隨機引物，滿足用于分析基因組多態性的引物要求。
⑶；
(5)；
(3)利用引物Y40對A組的DNA進行RAPD擴增，若在550bp出現特征性譜帶且 650bp無特征性譜帶則歸為Al組，進入步驟(31)；若在550bp和650bp都無特征性譜帶則歸為A2組，進入步驟(3 ；若在1400bp無特征性譜帶，柑橘品種‘解橙’被區分出來；若在 650bp出現特征性譜帶，柑橘品種‘不知火’被區分出來；
(31)利用引物5S2對Al組的DNA進行RAPD擴增，若在600bp無特征性譜帶，柑橘品種‘臍白橙’被區分出來；若在600bp出現特征性譜帶，柑橘品種‘甜香橙’被區分出來；
(32)利用引物Y41對A2組的DNA進行RAPD擴增，若在1400bp出現特征性譜帶則歸為A2-1組，進入步驟(321)；若在1400bp無特征性譜帶，柑橘品種‘伴野’被區分出來；對于利用上述引物快速鑒定區分柑橘品種的方法，包括如下步驟 (1)提取需要進行鑒定區分的柑橘DNA，稀釋備用； ⑵利用引物1S3對柑橘DNA進行RAPD擴增，若在480bp、600bp出現特征性譜帶且550bp無特征性譜帶則歸為A組，進入步驟若在480bp、550bp、600bp都出現特征性譜帶則歸為B組，進入步驟(4)； 若在480bp、550bp出現特征性譜帶且600bp無特征性譜帶則歸為C組，進入步驟
(321)利用引物A5對A2-1組的DNA進行RAPD擴增，若在IOOObp無特征性譜帶， 柑橘品種‘立間’被區分出來；若在IOOObp出現特征性譜帶，柑橘品種‘香橙’被區分出來；
(4)利用引物Y40對B組的DNA進行RAPD擴增，若在550bp和600bp都出現特征性譜帶且950bp無特征性譜帶則歸為Bl組，進入步驟；若在550bp和600bp都無特征性譜帶則歸為B2組，進入步驟0 ；若在600bp和950bp出現特征性譜帶且550bp無特征性譜帶則歸為B3組，進入步驟；若在550bp、600bp、950bp都出現特征性譜帶則歸為B4 組，進入步驟G4)；若在600bp出現特征性譜帶且550bp、950bp無特征性譜帶，柑橘品種 ‘早紅’被區分出來；若在600bp、1100bp出現特征性譜帶，柑橘品種‘上野’被區分出來；若在550bp出現特征性譜帶且600bp、950bp無特征性譜帶，柑橘品種‘代代，被區分出來；
(41)利用引物Y59對Bl組的DNA進行RAPD擴增，若在1800bp出現特征性譜帶則歸為Bl-I組，進入步驟Gll)；若在ISOObp無特征性譜帶，柑橘品種‘橋本’被區分出來；
(411)利用引物Y17對Bl-I組的DNA進行RAPD擴增，若在IOOObp出現特征性譜帶，柑橘品種‘日雜’被區分出來；若在IOOObp無特征性譜帶，柑橘品種‘立間’被區分出來；
(42)利用引物Y55對B2組的DNA進行RAPD擴增，若在300bp、;350bp、1200bp都出現特征性譜帶，柑橘品種‘粗皮’被區分出來；若在450bp、750bp都出現特征性譜帶，柑橘品種‘南柑’被區分出來；若在450bp出現特征性譜帶且750bp無特征性譜帶，柑橘品種湳豐蜜桔’被區分出來；若在300bp出現特征性譜帶，在350bp、1200bp未同時出現特征性譜帶的話，歸為B2-1組，進入步驟(421)；若在450bp、1200bp都無特征性譜帶則歸為B2-2組， 進入步驟022)；
(421)利用引物Y^對B2-1組的DNA進行RAPD擴增，若在^OObp出現特征性譜帶則歸為B2-11組，進入步驟0211)；若在^OObp無特征性譜帶則歸為B2-12組，進入步驟(4212)；
(4211)利用引物5S5對B2-11組的DNA進行RAPD擴增，若在850bp出現特征性譜帶，且在750bp或1200bp無特征性譜帶，品種‘HB柚’被區分出來；若在850bp、1200bp都出現特征性譜帶，品種‘原野’被區分出來；若在750bp、850bp都出現特征性譜帶，品種‘久能’被區分出來；若在850bp、1200bp都無特征性譜帶，品種‘大葯’被區分出來；若在850bp、 ISOObp都出現特征性譜帶，再利用引物1S2進行RAPD擴增，若在1300bp出現特征性譜帶則為‘料紅’；若在1300bp無特征性譜帶則為‘上下紅’；
(4212)利用引物1S2對B2-12組的DNA進行RAPD擴增，若在1300bp出現特征性譜帶，品種‘櫳柑1號’被區分出來；若在900bp出現特征性譜帶，品種‘青見’被區分出來； 若在1300bp和900bp都無特征性譜帶，品種‘市人’被區分出來；
(422)利用引物1S4對B2-2組的DNA進行RAPD擴增，若在750bp出現特征性譜帶，品種‘本早6號’被區分出來；若在750bp無特征性譜帶，品種‘橙柑3號’被區分出來；
(43)利用引物Y59對B3組的DNA進行RAPD擴增，若在1800bp有特征性譜帶則歸為B3-1組，進入步驟(431)；若在ISOObp無特征性譜帶則歸為B3-2組，進入步驟(432)；
(431)利用引物Y17對B3-1組的DNA進行RAPD擴增，若在1000bp、450bp都有特征性譜帶，品種‘扁紅檸檬’被區分出來；若在250bp、600bp都沒有特征性譜帶，品種‘黃皮’ 被區分出來；若在600bp有特征性譜帶，品種‘甘夏’被區分出來；若在1800bp、450bp都沒有特征性譜帶，品種‘砂糖桔’被區分出來；若在450bp有特征性譜帶且IOOObp無特征性譜帶則歸為一類，再用引物Y47進行擴增，如果在ISOObp有特征性譜帶則為品種‘英利曼I’， 如果在ISOObp無特征性譜帶則為品種‘立間’；
(432)利用引物Y60對B3-2組的DNA進行RAPD擴增，若在750bp有特征性譜帶， 品種‘晚白柚’被區分出來；若在SOObp有特征性譜帶，品種‘橙柑3號’被區分出來；若在 750bp、850bp都沒有特征性譜帶，品種‘西山大桔’被區分出來；
(44)利用引物Y59對B4組的DNA進行RAPD擴增，若在1200bp、1800bp都有特征性譜帶則歸為B4-1組，進入步驟041)；若在ISOObp出現特征性譜帶且1200bp無特征性譜帶則歸為B4-2組，進入步驟042)；若在1200bp和ISOObp都無特征性譜帶，品種‘福桔’ 被區分出來；
(441)利用引物Y17對B4-1組的DNA進行RAPD擴增，若在200bp和IOOObp都出現特征性譜帶，再利用引物YM進行擴增，若在ieoobp出現特征性譜帶則為品種‘甜橙柚’， 若在1600bp無特征性譜帶則為品種‘國慶4號’；若在200bp出現特征性譜帶且在IOOObp 無特征性譜帶，再利用引物Y23進行擴增，若在350bp出現特征性譜帶則為品種‘米津’，若在650bp出現特征性譜帶則為品種‘青鳥’，若在350bp、650bp都無特征性譜帶則為品種‘三保’；若在IOOObp出現特征性譜帶且200bp無特征性譜帶，品種‘興津3號’被區分出來；若在IOOObp無特征性譜帶，品種‘北口’被區分出來；
(442)利用弓丨物Y23對B4-2組的DNA進行RAPD擴增，若在250bp出現特征性譜帶，品種‘國慶5號’被區分出來；若在250bp無特征性譜帶，品種‘溫柑3號’被區分出來；(5)利用引物Y40對C組的DNA進行RAPD擴增，若在650bp出現特征性譜帶，品種被區分出來；若在650bp無特征性譜帶，品種‘胡柚’被區分出來。 該方法的RAPD擴增為30 μ 1的PCR反應體系，包括10XPCR Buffer 3 μ 1， 2. 5mmol/LdNTPs 2· 4 μ 1，25mmol/LMgCl2l. 8 μ 1，1. ZSUiTaq 酶，隨機引物 lOpmol/μΙ 1. 2μ 1，模板DNA40 50ng ；反應于95°C預變性3min ；94°C變性30s,復性lmin，72°C延伸 2min，42 個循環；72°C延伸 IOmin0
所述RAPD擴增反應中各引物的退火溫度如下表所示
‘小文旦’
引物退火溫度/°c引物退火溫度/°cY1741.7Y5942.8Y2342.8Y6042.8Y2842.81S243.7Y4042.81S344.8Y4141.71S444.8Y4741.75S244.8Y5443.75S544.8Y5542.8A542.8
須知，這里的退火溫度指復性時的退火溫度。
本發明通過16個引物就可對48個柑橘品種進行區分和鑒定，為了清晰、完整地表示鑒定采用的引物和鑒別出的品種，同時為了方便他人對柑橘品種進行區分、鑒定，本發明還建立了“樹型鑒別圖”。所述樹型鑒別圖是基于PCR擴增后的譜帶形態統計出的結果，樹型鑒別圖以引物作為節點，節點后是該引物對不同品種的區分結果，包括區分出的類別或者直接區分出來的品種，在節點后的分支還標記了不同結果相互區分的依據，即譜帶之間的區別。例如:650bp (+)表示在650bp有特征性譜帶；1200bp (-)表示在1200bp無特征性譜帶。為了方便樹型鑒別圖的使用，將48個品種的柑橘用編號標記如表1所示，“樹型鑒別圖”請參考“說明書附圖”中的

圖1。
表148個柑橘品種名稱及對應編號
權利要求
1.一種快速區分柑橘品種的引物，其特征在于包括 Y17 :5’ -AGGGGTCTTGG-3，，Y23 :5’ -GGACCCAACCG-3，， Y28 :5’ -GTGTGCCCCAT-3，， Y40 :5’ -AGCGTCCTCCT-3，， Y41 :5’ -AGCGTCCTCCG-3，， Y47 :5’ -ACGACCGACAG-3，， Y54 :5’ -TGGTGGCGTTC-3，， Y55 :5’ -ACCCCCGACTT-3，， Y59 :5’ -ACCCCCGACTG-3，， Y60 :5’ -ACCCCCGACTC-3，，152:5’ -GGGTAACGCCA-3，，153:5’ -GGGTAACGCCT-3，，154:5’ -GGGTAACGCCT-3，， 5S2 :5’ -CCGCTACCGAA-3，， 5S5 :5’ -CCGCTACCGAG-3，， A5 5' -GTCCACACGGT-3'；
2.根據權利要求1所述的一種快速區分柑橘品種的引物，其特征在于，所述引物是通過針對柑橘基因組設計的隨機引物經3次梯度PCR篩選出條帶清晰、PCR產物重復出現的引物。
3.一種利用權利要求1所述引物快速鑒定區分柑橘品種的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)提取需要進行鑒定區分的柑橘DNA，稀釋備用；(2)利用引物1S3對柑橘DNA進行RAPD擴增，若在480bp、600bp出現特征性譜帶且550bp無特征性譜帶則歸為A組，進入步驟(3)； 若在480bp、550bp、600bp都出現特征性譜帶則歸為B組，進入步驟(4)； 若在480bp、550bp出現特征性譜帶且600bp無特征性譜帶則歸為C組，進入步驟(5)；(3)利用引物Y40對A組的DNA進行RAPD擴增，若在550bp出現特征性譜帶且650bp無特征性譜帶則歸為Al組，進入步驟(31)； 若在550bp和650bp都無特征性譜帶則歸為A2組，進入步驟(32)； 若在1400bp無特征性譜帶，柑橘品種‘解橙’被區分出來； 若在650bp出現特征性譜帶，柑橘品種‘不知火’被區分出來；(31)利用引物5S2對Al組的DNA進行RAPD擴增，若在600bp無特征性譜帶，柑橘品種‘臍白橙’被區分出來； 若在600bp出現特征性譜帶，柑橘品種‘甜香橙’被區分出來；(32)利用引物Y41對A2組的DNA進行RAPD擴增，若在1400bp出現特征性譜帶則歸為A2-1組，進入步驟(321)； 若在1400bp無特征性譜帶，柑橘品種‘伴野’被區分出來； (321)利用引物A5對A2-1組的DNA進行RAPD擴增，若在IOOObp無特征性譜帶，柑橘品種‘立間’被區分出來； 若在IOOObp出現特征性譜帶，柑橘品種‘香橙’被區分出來； (4)利用引物Y40對B組的DNA進行RAPD擴增，若在550bp和600bp都出現特征性譜帶且950bp無特征性譜帶則歸為Bl組，進入步驟 (41)；若在550bp和600bp都無特征性譜帶則歸為B2組，進入步驟02)； 若在600bp和950bp出現特征性譜帶且550bp無特征性譜帶則歸為B3組，進入步驟 (43)；若在550bp、600bp、950bp都出現特征性譜帶則歸為B4組，進入步驟04)； 若在600bp出現特征性譜帶且550bp、950bp無特征性譜帶，柑橘品種‘早紅，被區分出來；若在600bp、1100bp出現特征性譜帶，柑橘品種‘上野’被區分出來；若在550bp出現特征性譜帶且600bp、950bp無特征性譜帶，柑橘品種‘代代，被區分出來；(41)利用引物Y59對Bl組的DNA進行RAPD擴增，若在ISOObp出現特征性譜帶則歸為Bl-I組，進入步驟011)； 若在ISOObp無特征性譜帶，柑橘品種‘橋本’被區分出來； (411)利用引物Y17對Bl-I組的DNA進行RAPD擴增， 若在IOOObp出現特征性譜帶，柑橘品種‘日雜’被區分出來； 若在IOOObp無特征性譜帶，柑橘品種‘立間’被區分出來；(42)利用引物Y55對B2組的DNA進行RAPD擴增，若在300bp、350bp、1200bp都出現特征性譜帶，柑橘品種‘粗皮，被區分出來；若在450bp、750bp都出現特征性譜帶，柑橘品種‘南柑’被區分出來；若在450bp出現特征性譜帶且750bp無特征性譜帶，柑橘品種‘南豐蜜桔’被區分出來；若在300bp出現特征性譜帶，在350bp、1200bp未同時出現特征性譜帶的話，歸為B2-1 組，進入步驟G21)；若在450bp、1200bp都無特征性譜帶則歸為B2-2組，進入步驟022)； (421)利用引物Y28對B2-1組的DNA進行RAPD擴增， 若在^OObp出現特征性譜帶則歸為B2-11組，進入步驟0211)； 若在^OObp無特征性譜帶則歸為B2-12組，進入步驟0212)； (4211)利用引物5S5對B2-11組的DNA進行RAPD擴增，若在850bp出現特征性譜帶，且在750bp或1200bp無特征性譜帶，品種‘HB柚，被區分出來；若在850bp、1200bp都出現特征性譜帶，品種‘原野’被區分出來； 若在750bp、850bp都出現特征性譜帶，品種‘久能’被區分出來； 若在850bp、1200bp都無特征性譜帶，品種‘大葯’被區分出來； 若在850bp、1800bp都出現特征性譜帶，再利用引物1S2進行RAPD擴增，若在1300bp 出現特征性譜帶則為‘料紅’；若在1300bp無特征性譜帶則為‘上下紅’；(4212)利用引物1S2對B2-12組的DNA進行RAPD擴增， 若在1300bp出現特征性譜帶，品種‘櫳柑1號’被區分出來； 若在900bp出現特征性譜帶，品種‘青見’被區分出來； 若在1300bp和900bp都無特征性譜帶，品種‘市人’被區分出來； (422)利用引物1S4對B2-2組的DNA進行RAPD擴增， 若在750bp出現特征性譜帶，品種‘本早6號’被區分出來； 若在750bp無特征性譜帶，品種‘橙柑3號’被區分出來；(43)利用引物Y59對B3組的DNA進行RAPD擴增，若在ISOObp有特征性譜帶則歸為B3-1組，進入步驟031)； 若在ISOObp無特征性譜帶則歸為B3-2組，進入步驟032)；(431)利用引物Y17對B3-1組的DNA進行RAPD擴增，若在1000bp、450bp都有特征性譜帶，品種‘扁紅檸檬’被區分出來； 若在250bp、600bp都沒有特征性譜帶，品種‘黃皮’被區分出來； 若在600bp有特征性譜帶，品種‘甘夏’被區分出來； 若在1800bp、450bp都沒有特征性譜帶，品種‘砂糖桔’被區分出來； 若在450bp有特征性譜帶且IOOObp無特征性譜帶則歸為一類，再用引物Y47進行擴增，如果在ISOObp有特征性譜帶則為品種‘英利曼I’，如果在ISOObp無特征性譜帶則為品種‘立間’；(432)利用引物Y60對B3-2組的DNA進行RAPD擴增， 若在750bp有特征性譜帶，品種‘晚白柚’被區分出來； 若在SOObp有特征性譜帶，品種‘橙柑3號’被區分出來；若在750bp、850bp都沒有特征性譜帶，品種‘西山大桔’被區分出來；(44)利用引物Y59對B4組的DNA進行RAPD擴增，若在1200bp、1800bp都有特征性譜帶則歸為B4-1組，進入步驟041)；若在ISOObp出現特征性譜帶且1200bp無特征性譜帶則歸為B4-2組，進入步驟042)；若在1200bp和ISOObp都無特征性譜帶，品種‘福桔’被區分出來；(441)利用引物Y17對B4-1組的DNA進行RAPD擴增，若在200bp和IOOObp都出現特征性譜帶，再利用引物YM進行擴增，若在1600bp出現特征性譜帶則為品種‘甜橙柚’，若在I600bp無特征性譜帶則為品種‘國慶4號’；若在200bp出現特征性譜帶且在IOOObp無特征性譜帶，再利用引物Y23進行擴增，若在350bp出現特征性譜帶則為品種‘米津’，若在650bp出現特征性譜帶則為品種‘青鳥’， 若在350bp、650bp都無特征性譜帶則為品種‘三保，；若在IOOObp出現特征性譜帶且200bp無特征性譜帶，品種‘興津3號’被區分出來； 若在IOOObp無特征性譜帶，品種‘北口’被區分出來；(442)利用引物Y23對B4-2組的DNA進行RAPD擴增， 若在250bp出現特征性譜帶，品種‘國慶5號’被區分出來； 若在250bp無特征性譜帶，品種‘溫柑3號’被區分出來；(5)利用引物Y40對C組的DNA進行RAPD擴增，若在650bp出現特征性譜帶，品種‘小文旦’被區分出來；若在650bp無特征性譜帶，品種‘胡柚’被區分出來。
4.根據權利要求3所述的一種快速鑒定區分柑橘品種的方法，其特征在于該方法的 RAPD擴增為 30μ 1 的PCR 反應體系，包括 10XPCR Buffer 3 μ 1,2. 5mmol/L dNTPs2. 4 μ 1, 25mmo VLMgCl2 1· 8 μ 1，1. 25UTaq 酶，隨機引物 lOpmol/μ 1 1. 2 μ 1，模板 DNA40 50ng ； 反應于95°C預變性3min ；94°C變性30s,復性lmin，72°C延伸2min，42個循環；72°C延伸 IOmin0
5.根據權利要求4所述的一種快速鑒定區分柑橘品種的方法，其特征在于所述RAPD 擴增反應中各引物的退火溫度如下表所示
全文摘要
本發明公開了一種快速區分柑橘品種的引物和方法，屬于分子生物學分子標記領域，本發明針對柑橘的基因序列設計RAPD隨機引物，經篩選后得到16個隨機引物；提取若干柑橘品種的DNA，稀釋備用；逐個利用隨機引物擴增未知柑橘品種的DNA，將得到的具有唯一特異性譜帶的品種區分出來，建立樹型鑒別圖。本發明通過幾次PCR就能夠將48個柑橘品種在分子水平上區分開，并在一定程度上體現了利用11堿基的引物進行RAPD分子標記在植物品種鑒定上具有實用性，所得的樹型鑒別圖比聚類樹更具直觀性，即根據品種鑒定圖就可以找出能區分任意兩個品種的引物，該方法可以實現柑橘苗木的早期鑒定，在其他物種上也具有廣泛的通用性。
文檔編號C12N15/11GK102492774SQ20111040772
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者孫欣, 宋長年, 張曉瑩, 李曉穎, 王化坤, 王西成 申請人:南京農業大學