專利名稱：水稻花期干旱脅迫應答蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種水稻花期可以有效應答干旱脅迫的蛋白及其編碼基因，以及這種基因的調控元件在水稻抗旱中的應用。
背景技術：
隨著世界環境的變化和人口數目的增多，糧食問題越來越突出，尤其是對于人口基數大的發展中國家。水稻是在亞洲地區廣泛種植的一種主要糧食作物，已經有上千年的種植歷史。但是水稻的種植對淡水資源的需求量很大。隨著全球氣候的不斷變化，在一些地區已經出現了氣候的異常，如雨季，河流汛期的改變等等，會造成一些水稻主要產區的水資源的短缺，對水稻的產量影響很大。在我國的北方地區溫度條件已經可以滿足水稻的生長， 而且由于北方地區晝夜溫差大的氣候特點反倒會促進水稻糖分的積累，種出的水稻具有口感好，糖粉積累多等優點，只是因為水資源不夠豐富而沒辦法大力推廣種植，所以在全國范圍內對于耐旱品種的研究和推廣就很有必要。
水稻作為一種淡水資源依存度比較高的農作物，對干旱非常敏感。與其他植物相比，水稻對水分脅迫更為敏感，水分虧缺會使植株發育受阻，分蘗減少，花粉敗育，產量減少等。植物生理學家和育種專家對水稻的長期種植實踐和觀察發現，生殖發育時期有幾個階段對外界逆境非常敏感，此時遭受脅迫可能會導致產量的大幅度下降，比如說水稻的第一苞分化至穎花原基分化始期(決定花的個數)，減數分裂期(決定雌雄育性)，灌漿期(決定種子飽滿程度，千粒重)。這些時期遭受干旱脅迫會使得花的個數減少、穎花退化、空癟等(楊弘遠編著.水稻生殖生物學.2005，浙江大學出版社)。近年來對于植物對干旱響應過程的研究表明，植物遭遇干旱逆境時，植物體迅速感知外部信號，并迅速傳導到細胞內部，進而激活許多干旱脅迫應答基因的表達，在植物體內產生大量的特異性蛋白，協同調節植物生理生化一級代謝的變化，從而提高對干旱的耐性。同時隨著水稻全基因測序工作的完成，針對水稻組織的全基因組表達技術如基因芯片、 蛋白質組分析等的不斷發展和完善，使得我們分析克隆水分虧缺條件下的響應基因，進而從中發現新的抗旱基因和抗旱調控元件成為可能。
發明內容
本發明的目的是提供一個來源于水稻的可應答干旱脅迫的蛋白及其編碼基因，以及該編碼基因的調控元件在報告水稻干旱程度中的應用。本發明對處于花期的水稻進行干旱脅迫處理，利用基因芯片技術進行轉錄譜分析，篩選出一個干旱脅迫后誘導表達的基因0s01g0702500。0s01g0702500是一個脫水素蛋白，能穩定細胞膜和許多大分子的結構以避免脫水對細胞造成的傷害，在抗旱過程中起到重要作用。對基因徹似冰進一步分析后發現，該基因的表達圖譜具有非常高的專一性，且該基因的啟動子為誘導型啟動子，故0s01g0702500僅在受到干旱脅迫的水稻花穗中特異表達，以抵御干旱逆境。利用這一特性，本發明在該基因的啟動子3’端連接一個報告基因GUS，在植物受到干旱逆境脅迫時，報告基因便開始表達，經過一種便捷有效的染色方法就可以估量植物水分的缺失，以便及時補救，有效減少甚至避免損失。flsiV冰蛋白及其編碼基因的特性讓我們對此基因在研究抗旱功能方面有很高的期望，對深入研究植物抗旱機制及功能有重大意義。而該基因的啟動子不僅可以通過驅動報告基因表達提供了一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的手段，同時這個啟動子還可以驅動其他抗旱基因，使植物受到干旱脅迫時超量表達特定的抗旱蛋白，以抵御干旱的傷害。因而本發明涉及的這種可以有效應答水稻干旱脅迫的蛋白及其編碼基因，以及這種基因的有效的專門響應干旱刺激的啟動元件在水稻抗旱中應用前景廣闊。本發明所提供的可應答干旱的基因，名稱為0s01g0702500,來源于水稻 sativa ssp. japonica)；是下述氨基酸殘基序列之一
1)序列SEQ ID No 1 ；
2)將序列SEQID No :1的氨基酸殘基序列經過一至二十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對植物的生長發育具有調控作用的蛋白質。序列SEQ ID No: 1由188個氨基酸殘基組成。編碼本發明0s01g0702500,是下述核苷酸序列之一
1)序列SEQID No:2的核苷酸序列；
2)編碼序列SEQID No: 1蛋白質序列的DNA ；
3)與序列SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；
4)在高嚴謹條件下可與序列SEQID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件為用0. IX SSPEO^O. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液，在65 °C下雜交
并洗膜。序列SEQ ID No:2由567個堿基組成，其編碼框為自5’端第1位堿基，編碼具有序列表中的SEQ ID No: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質。本發明所提供的可應答干旱的基因OsOl的702500的調控元件為該基因的啟動子區域，是是下述核苷酸序列之一
1)序列SEQID No:3的核苷酸序列；
2)與序列SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；
3)在高嚴謹條件下可與序列SEQID No:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件為用0. IX SSPEO^O. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液，在65 °C下雜交
并洗膜。本發明還提供含有本發明基因及其專門響應干旱刺激的啟動子元件的重組表達載體、轉基因細胞系和工程菌以及擴增該序列中任一片段的引物對。本發明還提供一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的方法。在實際應用中，將0s01g0702500的啟動子(promoter)與報告基因Gtt 融合，將該構建0s01g0702500p-GUS轉化水稻，可以估量植物水分的缺失。上述重組表達載體均可按照常規方法構建。本發明的flsiV冰是一個抗旱基因，可以在水稻花期受到干旱脅迫時大量表達，以抵御干旱逆境。而0s01r0702500d-GUS的轉基因植株可以報告水稻水分的缺失。本發明不但提供了一種抗旱基因，更提供了一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的方法，同時也對深入研究植物抗旱機制及功能有重大意義。即本發明基因的調控元件可在水稻抗旱中的獲得應用。本發明的蛋白質及其編碼基因具有較高的實際應用價值，應用前景廣闊。
圖1為水稻幼苗(seedling)、未進行干旱處理的水稻花序(flower)和進行干旱處理后的水稻花序(drought-induced flower)中As似冰的表達水平。圖2為pCAMBIA1301-flsi 7冰轉化水稻植株與野生型水稻經過干旱處理后花苞中的⑶S染色結果。
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。所用引物由英駿生物技術有限公司完成，測序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。實施例1.水稻抗旱基因0s01ff0702500的篩選。在水稻二級枝梗形成時，停止灌溉，監測土壤含水量，使之保持在20-30%，持續一周。取水稻花苞為材料，提取總 RNA (Promega，SV total RNA isolation system), 通過基因芯片比較分析對照植物與被脅迫植物的基因表達譜，初步篩選到一些候選基因，0s01ff0702500便是其中之一。以水稻幼苗時期(seedling)、未受干旱脅迫的花期 (flower)、受到干旱脅迫的花期(drought-induced flower)的總RNA為模板，用AMV反轉錄酶(TaKaRa)合成cDNA (依據Plant RT — PCR Kit 2. 01 (TaKaRa)的用戶手冊進行)，用熒光定量PCR試劑盒STOR Premix Ex Taq (TaKaRa)檢測對照植物與被脅迫植物中0s01ff0702500的表達情況(依據TaKaRa的用戶手冊進行)。所用5’和3’引物分別為 5’-TGTGACAGTGTGACTGTGAGGC-3’ (SEQ ID No:4
)和 5’- CAAACCCAACACACAACGCTA-3’ (SEQ ID No:5)。反應按照下列程序進行預變性95°C 3分鐘，1個循環；變性95°C 10秒，退火與延伸60°C 30秒，40個循環。對比該基因的在幼苗時期(seedling)、未受干旱脅迫的花期(flower)和受到干旱脅迫的花期 (drought-induced flower)的表達量，我們發現0s01g0702500的表達具有非常高的專一性，僅在受到干旱脅迫后的水稻花穗中特異表達(圖1)。實施例2. AsiV冰洲啟動子的克隆。提取水稻總DNA，以水稻總DNA為模板，PCR擴增0s01ff0702500的啟動子部分。(引物序列分別為5，-AAGCTTTTTGCACTGTTGTATTTTTTGA-3，(SEQ ID No:6)， 5，-CCATGGTGGTTGGTGTCGTCGAGTTGCT — 3，( SEQ ID No:7 )。50ul PCR 反應體系包含模板 2ul，高保真酶 KOD plus (Τ0Υ0Β0) lul，10X 緩沖液 5ul，2. 5uM dNTP 8ul，20uM 的 5， 和3，引物各lul，水32ul。反應條件為94°C預變性2分鐘；94°C變性30秒，55°C退火1分鐘，68 °C延伸2分30秒，共30個循環。，然后將PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化得到2040bp的擴增片段。PCR產物經歷id III和AfcoI酶切位點克隆到大腸桿菌表達載體 pCAMBIA1301 桿菌表達質粒 OCkM&lkl30l-0s01ff0702500p-GUSo實施例3.重組質粒PCAMBIA1301- fe似冰7似頒伽-g依轉化水稻植株。將重組質粒pCAMBIA1301_fe似冰依轉化到水稻中。參照Hiei等(PlantMol Biol, 1997,35 :205 — 218)的方法轉化水稻。將質粒dCAMBIA1301 -Qs01s0702500d-GUS 通過電激法轉入根瘤農桿菌EH105中，經篩選獲得陽性克隆。將攜帶質粒 pCAMBIA1301-fe似冰依的農桿菌EH105接種到5ml含100mg/L卡那霉素的YEB液體培養基中，28°C搖菌培養至對數生長期晚期，再1 :100擴大培養到0D600為0.5左右。收集農桿菌菌體并重懸于轉染培養基中。按照常規方法浸染水稻日本晴的愈傷組織，經共培養感染、抗性培養基篩選及分化培養基上分化得到潮霉素抗性的陽性苗。待小苗長至IOcm 左右時，將小苗移至室外網室種植，收種即得Tl代種子。實施例4.質粒x^kWAkY^l-OsOlg0702500d-GUS轉基因水稻棺株報告干旱脅迫效果的檢測。將得到的轉基因水稻Tl代種子與野生型水稻正常種植，在花期初期對兩組水稻進行為期1周的干旱處理。取兩組水稻的花序浸于⑶S染色中，于37°C放置24h后，70%乙醇浸泡Mh以洗脫雜色，觀察經過干旱處理與對照組的花器染色程度。圖2即為轉基因水稻植株和野生型水稻花序的GUS染色結果。未受干旱處理的轉基因水稻植株，其花序里報告基因⑶S的表達水平非常之低，而受過干旱處理的轉基因水稻植株，其報告基因卻呈現了高度表達，因而證明了的啟動子為一種干旱誘導型的啟動子，在植物受到干旱脅迫后在花器官中誘導表達。同時我們的結果還提供了一種檢測植株水分缺虧的方法，即通過便捷有效的染色就可以估量植物水分的缺失，以便及時補救，有效減少甚至避免損失。
權利要求
1.一種水稻花期干旱脅迫應答蛋白，其特征在于具有下述氨基酸殘基序列之一(1)序列SEQ ID No 1 ；(2)將序列SEQID No: 1的氨基酸殘基序列經過一至二十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對植物的生長發育具有調控作用的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述的干旱脅迫應答蛋白的基因，其特征在于為下述核苷酸序列之(1)序列SEQID No:2的核苷酸序列；(2)編碼序列SEQID No: 1蛋白質序列的DNA ；(3)與序列SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；(4)在高嚴謹條件下可與序列SEQID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的干旱脅迫應答蛋白的基因的調控元件，即該基因的啟動子，其特征在于為下述核苷酸序列之一(1)序列SEQID No:3的核苷酸序列；(2)與序列SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；(3)在高嚴謹條件下可與序列SEQID No:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權利要求2或3所述的水稻花期干旱脅迫應答基因及其調控元件的表達載體。
5.含有權利要求2或3所述的水稻花期干旱脅迫應答基因及其調控元件的轉基因細胞系。
6.含有權利要求2或3所述的水稻花期干旱脅迫應答基因及其調控元件的工程菌。
7.擴增權利要求2或3所述的水稻花期干旱脅迫應答基因及其調控元件中任一片段的引物對。
8.如權利要求2或3所述的水稻花期干旱脅迫應答基因及其調控元件在植物生長發育中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于將所述水稻花期干旱脅迫應答基因的調控元件啟動子區域與報告基因Gtt？融合后轉化水稻，在受過干旱處理的轉基因水稻植株里， 其報告基因呈現誘導表達。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體為一種水稻花期干旱脅迫應答蛋白及其編碼基因與應用。本發明的蛋白的氨基酸殘基序列如SEQIDNo1所示；編碼所述蛋白的干旱脅迫應答蛋白的基因的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示；本發明還提供一個水稻抗旱基因及建立于此基因調控元件基礎上的有效檢測植物所受干旱脅迫程度的方法。經檢測，該方法具有快速、有效估量水稻植株所受干旱的特點。本發明為植物缺水檢測提供了一種快速、便捷、有效的方法，并為植物抗旱研究及干旱育種提供了一個優質基因，具有較高的實際應用價值，應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/29GK102432678SQ20111040270
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者俞瑜, 董愛武, 金菁, 隋鵬飛 申請人:復旦大學