專利名稱：包含脫水素功能域的基因及其抗旱抗堿基因工程應用的制作方法
技術領域：
本發明屬植物基因工程技術領域，具體涉及運用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表達一種與植物抗逆相關的蛋白AcDHN。
背景技術：
自然界中存在多種如鹽、堿、高溫、低溫、干旱、病蟲害等多種生物和非生物脅迫， 限制了作物的生長發育，從而影響作物產量直接威脅到糧食安全，因此，將抗逆境脅迫的基因轉入作物中進行分子育種改良作物性狀引起了科研工作者的興趣。而克隆逆境相關基因及其功能的研究能夠為通過基因工程進行植物抗逆育種提供有價值的信息和材料。但是， 當前很多研究主要集中在草本植物，很少對木本植物特別是鹽生木本植物進行分子遺傳學的研究。木本植物和草本植物在應對生物和非生物脅迫時在結構、生長、發育以及生理等方面存在差異性，因此克隆和研究木本植物中與抗逆相關的基因能夠為通過基因工程提高作物對生物和非生物脅迫的耐受力提供更多的候選基因。四翅濱藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是藜科，濱藜屬木本植物，是干旱、 半干旱地區的典型植物，在年降雨量180mm以上，年均氣溫5°C左右，極端最低溫度_40°C的干旱、半干旱荒漠、鹽堿地生長良好，種源產地海拔2377m，人工栽植區已達3150m。據報道四翅濱藜被有些國家稱為“生物脫鹽器”，種6. 07畝四翅濱藜，一年能從土壤中吸收It以上的鹽分，是荒漠、半荒漠山旱地極有價值的優良飼料灌木，高產優質、富含營養，枝葉含12% 以上的粗蛋白，生物量達15t/hm2，同時有積累硒的能力，在美國廣泛用于路坡固定和水土保持，但主要還是用于牧場改良。在印度，從美國等國引進了 12種濱藜品種改良了 700萬 hm2的鹽堿地，突尼斯和北非一些國家為開發鹽堿地資源已有2萬hm2荒漠地種植了濱藜，在澳大利亞、南非、北非、以色列和北美地區濱藜是干旱半干旱地區最主要的飼料灌木之一， 也是綠化和水土保持的優良樹種。近幾年先后在我國甘肅、青海、新疆、寧夏等地進行了區域性引種栽培試驗，顯示了極強的耐干旱、低溫、貧瘠、抗鹽堿等優良特性。釀酒酵母菌&iccharomyces cerevisiae不僅具有生長快、容易培養和易于遺傳操作等優點，而且具有典型真核系統的特性，具有糖基化、二硫鍵形成以及蛋白質折疊等翻譯后加工等過程，其表達模式與植物表達模式更為接近，所以用酵母篩選植物抗逆基因具有原核表達系統不可替代的優越性。采用酵母突變體篩選植物的不同cDNA文庫來鑒定和挖掘新基因的方法已經廣泛應用于植物功能基因的研究。用酵母的2種不同氨基酸轉運缺陷突變體篩選擬南芥cDNA文庫，Frommer等和Hsu等(1993年)成功地克隆到相應的編碼相同氨基酸透過酶的NAT2/AAP1。酵母表達系統還被廣泛地應用到植物耐鹽基因功能研究中，Yamada等(2002年)利用酵母表達體系驗證了丙二烯環化氧化酶(AOC)基因大大增強轉化子的耐鹽性，從而表明AOC基因在真核表達系統中增強抗鹽脅迫的功能。唐玉林等 (2007年)利用酵母表達系統研究大豆SAL 13-2蛋白功能，將大豆SAL 13-2蛋白cDNA及其缺失片段構建到酵母表達載體PYES2上，并轉化酵母菌INV&1，檢測酵母重組子在脅迫條件下的生長狀況，結果表明，SALI3-2基因可明顯提高酵母轉化子的耐鹽能力。釀酒酵母菌株INVkl (基因型為MATa his3Dlleu2 trp 1-289 ura3_52)是一種二倍體，并且生長迅速的理想酵母表達菌株，該菌株是人工改造的尿嘧啶營養缺陷型菌株，運用SC-U培養基篩選轉化子，假陽性率低，能夠保證轉化效率。脫水素(Dehydrin)屬于LEA家族，分子質量為9_200KDa，是一種廣泛存在于高等植物中的干旱誘導蛋白，在植物胚胎發生晚期產生。植株處于低溫、外源ABA、干旱、鹽堿以及胞外結晶等脫水脅迫的影響，會大量表達和積累這類蛋白。脫水素分子具有很高的親水性和熱穩定性，能將水分捕獲到細胞內，以保護細胞免受干旱和鹽堿的損傷。能在植物胚胎發育后期以及脫水素的重要結構特征是它具有三類非常保守的區域K、S和Y片段，其中K 片段是所有脫水素都具有的。K片段富含賴氨酸，通常位于C端，可具有1到12個重復，一般由15個氨基酸殘基組成(EKKGIMDKIKEKLPG)。許多脫水素還含有由絲氨酸殘基組成的S 片段，有證據表明S片段的磷酸化可以使脫水素在信號肽的引導下進入細胞核。很多脫水素的N端還具有另一類保守區域Υ片段，它的序列為(V/T)DEYGNP，與植物和細菌分子伴侶的核酸結合位點有同源性。其中，轉化pYES-AcDHN重組載體的酵母INVkl菌株在抗干旱和鹽堿脅迫中表現出較強抗性，在眾多研究中，還無有關含Dehydrin功能域的四翅濱藜基因在酵母抗逆和植物的抗逆生理功能方面的相關報道。
發明內容
本發明采用鹽生灌木植物四翅濱藜(Atriplex canescens)作為研究材料，通過構建低溫(-10°C )和鹽GOOmM NaCl)脅迫下四翅濱藜的全長運用hvitrogen公司 SuperScript Full-Length cDNA Library Construction Kit 構建全長 cDNA 文庫，并通過 Gateway技術LR重組到酵母表達載體pYES_DEST52中，混合質粒轉化酵母菌株INVkl，通過多種模擬逆境脅迫(鹽堿、凍害、高溫、SOS脅迫、干旱脅迫)篩選出與逆境脅迫相關的基因，為今后利用耐鹽堿、干旱、凍害、SOS脅迫基因獲得抗相應逆境脅迫的轉基因農作物和林木奠定基礎，同時也為四翅濱藜耐鹽堿和耐低溫分子機制研究提供依據。本發明使用酵母表達載體pYES_DEST52(購自^witrogen公司)，插入本發明 AcDHN蛋白核苷酸編碼序列以及得到重組表達載體pYES-AcDHN，它除了攜帶有AcDHN蛋白核苷酸編碼序列外，還有T7啟動子、GALl啟動子、CYCl終止轉錄信號、URA3基因、fl復制基因、PUC復制基因、酵母2 μ復制序列、氨芐青霉素抗性基因、attRl和attR2用于LR重組的重組位點、致死基因ccdB用于逆向篩選轉化子、氯霉素抗性基因用于對陽性轉化子的雙重篩選、Vkpitope便于重組后蛋白表達檢測、6xHis Tag用于重組基因純化，以及為外源蛋白高效表達所需的各種調控元件。AcDHN基因由1408個堿基組成，含有一個完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame) 1017bp,同時還提供5，-UTR和3，-UTR序列，AcDHN為序列表中的SEQ ID NO :1序列。開放讀碼框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。本發明的一個目的是提供含脫水素功能域的四翅濱藜中與植物抗逆相關的蛋白及其編碼基因，并進行應用。本發明所提供一種植物抗逆相關蛋白耐Na2C03、NaHCO3和干旱等脅迫，名稱為 AcDHN(Atriplexcanescens Dehydrin)，^ξ ΙΙ 0@ ^·。
一種植物抗逆相關蛋白AcDHN，其中包含如下兩類蛋白質(a)由序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代或缺失或添加且與植物抗逆相關的由序列表中SEQ ID NO :2衍生的蛋白質。序列表中SEQ ID NO 2由338個氨基酸殘基組成，其中91個疏水氨基酸，208個親水氨基酸，親水性極強，94個堿性氨基酸，79個酸性氨基酸，蛋白質分子量為38. 3kD，等電點為6. 47，其中富含賴氨酸(Lys)占總蛋白量的18. 33%，這也是Dehydrin家族蛋白的主要特征。四翅濱藜AcDHN蛋白未見報道。編碼基因AcDHN的編碼序列為序列表中SEQ ID NO 1的5，端第99-1113位脫氧
核苷酸。編碼基因AcDHN的編碼序列為下列之一1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示；2)編碼序列表中SEQ ID NO 2蛋白序列的核苷酸分子；3)與1)所述的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼植物抗逆相關蛋白 AcDHN的核苷酸分子；4)在高嚴謹條件下與1)所述的核苷酸序列雜交且編碼蛋白AcDHN的核苷酸分子。以上4)中所述高嚴謹條件是指可為在0. 1XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜的條件。一種重組表達載體含有植物抗逆相關蛋白AcDHN的編碼基因AcDHN。一種重組菌含有植物抗逆相關蛋白AcDHN的編碼基因AcDHN(以下簡稱編碼基因 AcDHN)。為了使(a)中的AcDHN便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或梭基末端連接上如表1所示的標簽。表1.標簽的序列
權利要求
1.一種植物抗逆相關蛋白AcDHN，其特征在于其中包含如下兩類蛋白質(a)由序列表中SEQID NO :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中SEQID NO 2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代或缺失或添加且與植物抗逆相關的由序列表中SEQ ID NO :2衍生的蛋白質。
2.按權利要求1所述植物抗逆相關蛋白AcDHN的編碼基因AcDHN，其特征在于所述的編碼基因AcDHN的編碼序列為序列表中SEQ ID NO=I的5，端第99-1113位脫氧核苷酸。
3.按權利要求2所述植物抗逆相關蛋白AcDHN的編碼基因AcDHN，其特征在于所述編碼基因AcDHN的編碼序列為下列之一1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQID NO 1所示；2)編碼序列表中SEQID NO 2蛋白序列的核苷酸分子；3)與1)所述的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述植物抗逆相關蛋白AcDHN的核苷酸分子；4)在高嚴謹條件下與1)所述的核苷酸序列雜交且編碼權利要求1所述植物抗逆相關蛋白AcDHN的核苷酸分子。
4.一種重組表達載體，其特征在于含有權利要求2或3所述植物抗逆相關蛋白AcDHN 的編碼基因AcDHN。
5.一種重組菌，其特征在于含有權利要求2或3所述植物抗逆相關蛋白AcDHN的編碼基因AcDHN。
全文摘要
包含脫水素功能域的基因及其抗旱抗堿基因工程應用屬植物基因工程技術領域，本發明提供一種植物抗逆相關蛋白AcDHN，包含由SEQ ID NO2氨基酸序列組成和將SEQ ID NO2的氨基酸序列經一個或幾個氨基酸殘基的取代或缺失或添加且由SEQ ID NO2衍生的蛋白質；編碼基因AcDHN的編碼序列如下列之一a.編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；b.編碼SEQ ID NO2蛋白序列的核苷酸分子；c.與a核苷酸序列具有90％以上同源性且編碼蛋白的核苷酸分子；d.與a的核苷酸序列雜交且編碼蛋白的核苷酸分子；將AcDHN導入釀酒酵母得到的轉基因釀酒酵母，可提升酵母耐干旱耐鹽堿能力。
文檔編號C12N1/15GK102492030SQ20111040113
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月6日 優先權日2011年12月6日
發明者余剛, 劉金亮, 張世宏, 李桂華, 潘洪玉, 王雪亮, 賈承國, 陳宣明 申請人:吉林大學