專利名稱：一種玻璃酸鈉的酶解方法
技術領域：
本發明涉及一種玻璃酸鈉的酶解方法。
背景技術：
玻璃酸(hyaluronic acid, HA)是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重復單位通過β-α — 4)糖苷鍵和β-α —幻糖苷鍵構成的無分支高分子糖胺聚糖，其重均分子量一般為10萬 1000萬Da，分子中兩種單糖的摩爾比為1 1。目前，酶解法制備低分子量HA和寡聚HA主要采用玻璃酸酶，其最適反應條件是 底物濃度為10g/L，酶濃度為150000U/L，反應液的pH值為5. 0，反應溫度為50°C ；如需制得分子量為1乂104的撤，酶解時間為池。控制反應時間，可制得不同分子量的HA，但是，目前酶活力為50萬u/g的醫藥級產品市場價為60萬元/Kg，致使用玻璃酸酶酶解玻璃酸的成本過高。另外，不同微生物來源的乳糖酶糖苷鍵鍵型作用存在特異性，實驗研究表明米曲霉乳耱酶的水解優先順序是0-1_6鍵> 0-1_4鍵> β-1-3鍵.乳酸克魯維酵母乳糖酶的水解順序則是0-1_4鍵> 0-1_6鍵> β-1-3鍵，而環狀芽孢桿菌對β-1-4鍵具有高度的鍵專一性。
發明內容
本發明的目的是提供一種反應條件溫和，生產成本低的玻璃酸鈉的酶解方法。為實現本發明的目的，本發明所采用的技術方案是—種玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將玻璃酸鈉溶解在pH值為6. 0-7. 0的磷酸鹽緩沖液中得溶液A ；(2)將步驟(1)所得的溶液A中加入β -半乳糖苷酶，于35-50°C酶解60-320min 后，加熱至70-85°C使酶失活，加熱時間為8-iaiiin得酶解液；(3)將步驟( 所得的酶解液進行絡合、解離、醇沉淀和真空干燥。在本發明的一優選實施例中，所述步驟(1)中，IL磷酸鹽緩沖液中加入玻璃酸鈉的量為5-10g，更優選為IL磷酸鹽緩沖液中加入玻璃酸鈉的量為10g。在本發明的一更優選實施例中，所述步驟(1)中，磷酸鹽緩沖液PH值為6. 4。在本發明的一優選實施例中，所述步驟O)中，IL溶液A中加入酶的量為 100000-2500000U，更優選為 1500000U。在本發明的一更優選實施例中，所述步驟O)，酶解溫度為50°C。在本發明的一更優選實施例中，所述步驟0)，快速加熱至75°C使酶失活，加熱時間為IOmin。在本發明的一優選實施例中，所述的β -半乳糖苷酶的微生物來源為環狀芽胞桿菌。在本發明的一優選實施例中，所述步驟(3)中，用氯代烷基十六吡啶進行絡合。
本發明與玻璃酸酶酶解玻璃酸鈉的最佳酶解條件反應液pH值5. 0，反應溫度 50°C相比，β -半乳糖苷酶的酶解條件反應液pH值6. 0-7. 0，反應溫度35-50°C更溫和。此外，雖然制得相同分子量玻璃酸鈉，所需半乳糖苷酶的酶用量要大于玻璃酸酶，但是同級別酶，每單位酶活力(U)的價格，玻璃酸酶價格為β-半乳糖苷酶的百倍以上，(醫藥級產品市場價β-半乳糖苷酶，酶活力5萬u/g，500元/Kg;玻璃酸酶，酶活力 50萬u/g，60萬元/Kg)。因此，本發明能夠大大降低制備低分子量玻璃酸鈉及其寡糖的生產成本。
具體實施例方式通過下面給出的本發明的具體實施例可以進一步清楚地了解本發明，但它們不是對本發明的限定。實施例1取0.2g玻璃酸鈉，分子量為118萬Da，溶解于裝有100ml pH值為6. 0磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物來源為環狀芽胞桿菌，酶用量為2000000U/L，于溫控為45°C的水浴振蕩器內酶解210min，反應結束后，快速升溫至75°C， 使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例2取0.5g玻璃酸鈉，分子量為100萬Da，溶解于裝有IOOml pH值為6. O磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物來源為環狀芽胞桿菌，酶用量為100000U/L，于溫控為45°C的水浴振蕩器內酶解180min，反應結束后，快速升溫至75°C， 使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例3取0.5g玻璃酸鈉，分子量為100萬Da，溶解于裝有IOOml pH值為6. 4磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物來源為環狀芽胞桿菌，酶用量為150000U/L，于溫控為45°C的水浴振蕩器內酶解^Omin，反應結束后，快速升溫至75°C， 使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例4取0.5g玻璃酸鈉，分子量為100萬Da，溶解于裝有IOOml pH值為6.4磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入半乳糖苷酶，其微生物來源為環狀芽胞桿菌，酶用量為 750000U/L，于溫控為50°C的水浴振蕩器內酶解60min，反應結束后，快速升溫至75°C，使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例5取0. 5g玻璃酸鈉，分子量為100萬Da，溶解于裝有IOOml pH值為7. O磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物來源為環狀芽胞桿菌，酶用量為500000U/L，于溫控為45°C的水浴振蕩器內酶解320min，反應結束后，快速升溫至75°C，使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例6取0. 5g玻璃酸鈉，分子量為100萬Da，溶解于裝有IOOml pH值為6. 4磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物來源為環狀芽胞桿菌，酶用量為1000000U/L，于溫控為50°C的水浴振蕩器內酶解120min，反應結束后，快速升溫至75°C， 使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例7取Ig玻璃酸鈉，分子量為100萬Da，溶解于裝有IOOml pH值為6. 4磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入半乳糖苷酶，其微生物來源為環狀芽胞桿菌，酶用量為 750000U/L，于溫控為50°C的水浴振蕩器內酶解60min，反應結束后，快速升溫至75°C，使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例8取Ig玻璃酸鈉，分子量為100萬Da，溶解于裝有IOOml pH值為6. 4磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入半乳糖苷酶，其微生物來源為環狀芽胞桿菌，酶用量為 1500000U/L，于溫控為50°C的水浴振蕩器內酶解150min，反應結束后，快速升溫至75°C，使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例9取Ig玻璃酸鈉，分子量為100萬Da，溶解于裝有IOOml pH值為6. 4磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入半乳糖苷酶，其微生物來源為環狀芽胞桿菌)酶用量為 1500000U/L，于溫控為50°C的水浴振蕩器內酶解210min，反應結束后，快速升溫至75°C，使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例10取Ig玻璃酸鈉，分子量為100萬Da，溶解于裝有IOOml pH值為6. 4磷酸緩沖液的燒杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶其微生物來源為環狀芽胞桿菌，酶用量為 1500000U/L，于溫控為45°C的水浴振蕩器內酶解MOmin，反應結束后，快速升溫至75°C，使酶失活lOmin，然后，經氯代烷基十六吡啶(CPC)絡合、解離、醇沉淀及真空干燥后得到HA供試品，采用HPGPC法檢測其分子量。實施例檢測數據匯總如下如表1所示表 權利要求
1 一種玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將玻璃酸鈉溶解在PH值為6.0-7. 0的磷酸鹽緩沖液中得溶液A ；(2)將步驟(1)所得的溶液A中加入β-半乳糖苷酶，于35-50°C酶解60-320min后， 加熱至70-85°C使酶失活，加熱時間為8-iaiiin得酶解液；(3)將步驟( 所得的酶解液進行絡合、解離、醇沉淀和真空干燥。
2.根據權利要求1所述玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，所述步驟(1)中，IL磷酸鹽緩沖液中加入玻璃酸鈉的量為5-10g。
3.根據權利要求1所述玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，所述步驟(1)中，IL磷酸鹽緩沖液中加入玻璃酸鈉的量為10g。
4.根據權利要求1所述玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，所述步驟(1)中，磷酸鹽緩沖液PH值為6.4。
5.根據權利要求1所述玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，所述步驟O)中，IL溶液A 中加入酶的量為100000-2500000U，更優選為1500000U。
6.根據權利要求1所述玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，所述步驟O)，酶解溫度為 50 "C。
7.根據權利要求1所述玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，所述步驟O)，快速加熱至 75°C使酶失活，加熱時間為lOmin。
8.根據權利要求1所述玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，所述的半乳糖苷酶的微生物來源為環狀芽胞桿菌。
9.根據權利要求1所述玻璃酸鈉的酶解方法，其特征在于，所述步驟(3)中，用氯代烷基十六吡啶進行絡合。
全文摘要
本發明涉及一種玻璃酸鈉的酶解方法，首先，將玻璃酸鈉溶解在pH為6.0-7.0的磷酸鹽緩沖液中；然后將所得的溶液中加入β-半乳糖苷酶，于35-50℃酶解60-320min后，快速升溫至70-85℃使酶失活，加熱時間為8-12min；最后，將所得的酶解液進行絡合、解離、醇沉淀和真空干燥。該方法比傳統的玻璃酸酶酶解玻璃酸鈉的方法條件更溫和，且在同等酶活力的前提下，可大大降低生產成本。
文檔編號C12P19/14GK102492755SQ20111038961
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月30日 優先權日2011年11月30日
發明者周寧輝, 顧其勝 申請人:上海景峰制藥有限公司