專利名稱：一種純化腈水解酶的方法
技術領域：
本發明屬于腈水解酶的純化技術領域，具體涉及一種以市售粗腈水解酶為原料， 純化得到高純度腈水解酶的方法。
二.
背景技術：
腈水解酶是一種具有廣泛底物適應性的生物催化劑，廣泛應用于化學工業、食品和農業。用腈水解酶實現腈基的水解，其優勢不僅在于反應條件溫和、環境友好，重要的是可以實現一般化學反應所不具有的手性選擇性。但是，市售的腈水解酶純度低，含有大量多糖、雜蛋白等雜質，常用作飼料添加劑和食品添加劑，很難滿足制備高附加值產品(如醫藥、化工等)需要高純度酶的條件，嚴重限制了腈水解酶的應用。因此，制備出高純度腈水解酶產品，達到制備高附加值產品的要求具有重要的意義。現有純化腈水解酶的方法，例如《安徽農業科學》2010年38卷11期的“木聚糖酶的超濾純化方法研究”一文，公開的方法是以木聚糖酶為原料，經過適當稀釋后，用不同分子量超濾柱進行超濾，或木聚糖酶不經稀釋，直接進行超濾，在超濾過程中添加檸檬酸緩沖劑進行稀釋。該方法的主要缺點①沒有對木聚糖酶原料進行預處理，利用率低，生產出的產品純度低，不能滿足制備高附加值產品的要求；②生產出的產品沒有進行后期添加保護劑處理，干燥時酶活力損失大，產品的催化效率低。
三.
發明內容
本發明的目的是針對現有純化腈水解酶方法的不足之處，提供一種純化腈水解酶的方法，具有工藝簡單，設備簡單易得，操作步驟實用，節約能源，無有害物質排放，產品純度高、活性高、穩定性好，資源綜合利用率高等特點。本發明的機理是利用超濾對粗酶進行預處理，除掉親水性大分子雜質；利用納濾技術，讓小分子雜質濾過而保留并濃縮目標物；利用在酶濃縮液中加入凍干保護劑，使酶的活性部位被得到保護，防止酶在凍干過程中失活或活性降低。實現本發明的目的技術方案是一種純化腈水解酶的方法，以市售粗腈水解酶為原料，經預處理、超濾分級、納濾濃縮、冷凍干燥的簡單工藝，制備出純化腈水解酶產品。其具體方法步驟如下(1)制備預處理液以市售的粗腈水解酶為原料，按照粗腈水解酶的質量(g)緩沖溶液的體積(mL) 比為1 80 120的比例，先將粗腈水解酶加入到緩沖溶液中，攪拌混合均勻后，再攪拌溶解20 30分鐘。然后將溶解液泵入真空抽濾機中，進行真空抽濾，分別收集抽濾濾過液和抽濾渣。對于收集的抽濾濾過液(即制備出預處理液)，用于下一步的處理；對于收集的抽濾渣，經烘干粉碎后，可用作飼料添加劑。其中，緩沖溶液為PH 8.0的硼砂-氯化鈣緩沖溶液或pH 9. 0的硼砂-氯化鉀緩沖溶液或pH 9. 18的硼砂-水緩沖溶液。(2)制備超濾液
第(1)步完成后，將第(1)步收集的抽濾濾過液泵入截留分子量為50 60KDa的超濾器中，在0. 05 0. 2MPa下，進行第一次超濾分離，直到第一次超濾截留液的體積減少至原體積的8 12%為止，分別收集第一次超濾濾過液和第一次超濾截留液。在收集的第一次超濾截留液中，加入去離子水，補充至原體積，再0. 05 0. 下，再進行第二次超濾分離，直到第二次超濾截留液的體積減少至原體積的8 12%為止，分別收集第二次超濾液和第二次超濾截留液。對于收集的第二次超濾截留液，因含有豐富的蛋白質，干燥后用作飼料添加劑；對于收集的第二次超濾濾過液，與收集的第一次超濾濾過液合并，就制備出超濾液，用于下一步處理。(3)制備納濾濃縮液第( 步完成后，將第( 步合并的第一、二次超濾濾過液泵入截留分子量為 400 600Da的納濾器中，再在0. 2 0. 4MPa下，進行納濾分離，直至第一次納濾截留液的體積減少至原體積的30 40%時為止，分別收集納濾濾過液和納濾截留液。在收集的納濾截留液中，加入去離子水補充至原體積，再在0.2 0. 下，再進行第二次納濾分離，直到第二次納濾截留液的體積減少至原體積的15 25%為止，分別收集第二次納濾濾過液和第二次納濾截留液。對于收集的第二次納濾濾過液，因含有豐富的礦質元素、氨基酸等營養物質，與收集的第一次納濾濾過液合并，濃縮后作飼料添加劑；對于收集的第二次納濾截留液(即為納濾濃縮液)，用于下一步的處理。(4)制備純化腈水解酶凍干粉第(3)步完成后，按照0.3 0.8%蔗糖溶液第(3)步收集的第二次納濾截留液的體積比為1 25 50的比例，先將蔗糖溶液加入到第二次納濾截留液中，攪拌均勻后， 再放置于-16 _20°C溫度下，預凍3 6小時，接著再放置于冷凍干燥機中，在30 60 真空度、-50 _60°C溫度下，進行冷凍干燥M 36小時，就制備出純化腈水解酶凍干粉。本發明采用上述技術方案后，主要有以下效果(1)本發明方法能有效除去粗腈水解酶中的多糖、雜蛋白、小分子礦質、氨基酸等雜質，產品中腈水解酶的活性高達36U，與腈水解酶粗品原料相比較，純化倍數達到5. 14， 純化效率高，產品的純度高，活性高，穩定性好，質量好，能滿足制備高附加值產品。(2)本發明在生產過程中，反應條件溫和，能耗低，脫除的雜蛋白等均回收利用于配制動物飼料添加劑，不排放。這不但有利于環境保護，還降低生產成本，提高了資源的綜合利用率。(3)本發明在生產過程中，方法簡單，主要使用抽濾、超濾及凍干機常規設備，不涉及昂貴的設備及儀器，因而生產設備簡單，操作簡便且易于控制，因此生產安全又降低生產成本，便于推廣應用。采用本發明方法制備出的產品可廣泛應用于醫藥、農業、化工、材料等行業中。具體實施例方式下面結合具體實施方式
，進一步說明本發明。實施例1一種純化腈水解酶的方法，具體方法步驟如下(1)制備預處理液
以市售的粗腈水解酶為原料，按照粗腈水解酶的質量(g)緩沖溶液的體積(mL) 比為1 80的比例，先將粗腈水解酶加入到緩沖溶液中，攪拌混合均勻后，再攪拌溶解20 分鐘。然后將溶解液泵入真空抽濾機中，進行真空抽濾，分別收集抽濾濾過液和抽濾渣。對于收集的抽濾濾過液(即制備出預處理液)，用于下一步的處理；對于收集的抽濾渣，經烘干粉碎后，可用作飼料添加劑。其中，緩沖溶液為PH 8.0的硼砂-氯化鈣緩沖溶液。(2)制備超濾液第(1)步完成后，將第(1)步收集的抽濾濾過液泵入截留分子量為50KDa的超濾器中，在0. 05MPa下，進行第一次超濾分離，直到第一次超濾截留液的體積減少至原體積的 8%為止，分別收集第一次超濾濾過液和第一次超濾截留液。在收集的第一次超濾截留液中，加入去離子水，補充至原體積，在0. 05MPa下，再進行第二次超濾分離，直到第二次超濾截留液的體積減少至原體積的8%為止，分別收集第二次超濾液和第二次超濾截留液。對于收集的第二次超濾截留液，因含有豐富的蛋白質，干燥后用作飼料添加劑；對于收集的第二次超濾濾過液，與收集的第一次超濾濾過液合并，就制備出超濾液，用于下一步處理。(3)制備納濾濃縮液第( 步完成后，將第( 步合并的第一、第二次超濾濾過液泵入截留分子量為 400Da的納濾器中，再在0. 下，進行納濾分離，直至第一次納濾截留液的體積減少至原體積的30%時為止，分別收集納濾濾過液和納濾截留液。在收集的納濾截留液中，加入去離子水補充至原體積，再在0. 2MPa下，再進行第二次納濾分離，直到第二次納濾截留液的體積減少至原體積的15%為止，分別收集第二次納濾濾過液和第二次納濾截留液。對于收集的第二次納濾濾過液，因含有豐富的礦質元素、氨基酸等營養物質，與收集的第一次納濾濾過液合并，濃縮后作飼料添加劑；對于收集的第二次納濾截留液(即為納濾濃縮液)，用于下一步的處理。(4)制備純化腈水解酶凍干粉第( 步完成后，按照0.3%蔗糖溶液第( 步收集的第二次納濾截留液的體積比為1 25的比例，先將蔗糖溶液加入到第二次納濾截留液中，攪拌均勻后，再放置于-16°C溫度下，預凍3小時，接著再放置于冷凍干燥機中，在30 真空度、-50°C溫度下， 進行冷凍干燥M小時，就制備出純化腈水解酶凍干粉。實施例2一種純化腈水解酶的方法，同實施例1，其中第(1)步中，粗腈水解酶的質量緩沖溶液的體積比為Ig IOOmL,攪拌溶解25 分鐘，其中，緩沖溶液為pH 9. 0的硼砂-氯化鉀緩沖溶液。第(2)步中，超濾器的截留分子量為55KDa，超濾壓力為0. IMPa，第一次超濾至超濾液體積減少至原體積的10%為止，第二次超濾至超濾液截留體積減少至原體積的10% 為止。第(3)步中，納濾器的截留分子量為500Da，納濾壓力為0. 3MPa，第一次納濾截留液體積減少至原體積的35%時為止，第二次納濾截留液體積減少至原體積的20%為止。第(4)步中，0.5%蔗糖溶液第(3)步收集的第二次納濾截留液的體積比為 1 35，對置于凍干瓶中的加入蔗糖溶液的第二次超濾截留液，在-18°C溫度下，預凍4. 5小時，在451 真空度、-55°C溫度下，進行冷凍干燥30小時。
實施例3一種純化腈水解酶的方法，同實施例1，其中第(1)步中，粗腈水解酶的質量緩沖溶液的體積比為Ig 120mL，攪拌溶解30 分鐘，其中，緩沖溶液為pH 9. 18的硼砂-水緩沖溶液。第(2)步中，超濾器的截留分子量為60KDa，超濾壓力為0. 2MPa，第一次超濾至超濾液體積減少至原體積的12%為止，第二次超濾至超濾液截留體積減少至原體積的12% 為止。第(3)步中，納濾器的截留分子量為600Da，納濾壓力為0. 4MPa，第一次納濾截留液體積減少至原體積的40%時為止，第二次納濾截留液體積減少至原體積的25%為止。第(4)步中，0.8%蔗糖溶液第(3)步收集的第二次納濾截留液的體積比為 1 50，對置于凍干瓶中的加入蔗糖溶液的第二次超濾截留液，在-20°C溫度下，預凍6小時，在601 真空度、_60°C溫度下，進行冷凍干燥36小時。
權利要求
1. 一種純化腈水解酶的方法，其特征在于具體方法步驟如下(1)制備預處理液以市售的粗腈水解酶為原料，按照粗腈水解酶的質量緩沖溶液的體積比為 Ig 80 120mL的比例，先將粗腈水解酶加入到緩沖溶液中，攪拌混合均勻后，再攪拌溶解20 30分鐘，然后將溶解液泵入真空抽濾機中，進行真空抽濾，分別收集抽濾濾過液和抽濾渣，其中，緩沖溶液為PH 8. 0的硼砂-氯化鈣緩沖溶液或pH 9. 0的硼砂-氯化鉀緩沖溶液或pH 9. 18的硼砂-水緩沖溶液；(2)制備超濾液第(1)步完成后，將第(1)步收集的抽濾濾過液泵入截留分子量為50 60KDa的超濾器中，在0. 05 0. 2MPa下，進行第一次超濾分離，直到第一次超濾截留液的體積減少至原體積的8 12%為止，分別收集第一次超濾濾過液和第一次超濾截留液，在收集的第一次超濾截留液，加入去離子水，補充至原體積，在0. 05 0. 2MPa下，再進行第二次超濾分離， 直到第二次超濾截留液體積減少至原體積的8 12%為止，分別收集第二次超濾液和第二次超濾截留液，并合并第一次超濾濾過液和第二次超濾濾過液；(3)制備納濾濃縮液第( 步完成后，將第( 步合并的第一、二次超濾濾過液泵入截留分子量為400 600Da的納濾器中，再在0. 2 0. 4MPa下，進行納濾分離，直至第一次納濾截留液的體積減少至原體積的30 40%時為止，分別收集納濾濾過液和納濾截留液，在收集的納濾截留液中，加入去離子水補充至原體積，在0. 2 0. 下，再進行第二次納濾分離，直到第二次納濾截留液的體積減少至原體積的15 25%為止，分別收集第二次納濾濾過液和第二次納濾截留液；(4)制備純化腈水解酶凍干粉第(3)步完成后，按照0.3 0.8%蔗糖溶液第C3)步收集的第二次納濾截留液的體積比為1 25 50的比例，先將蔗糖溶液加入到第二次納濾截留液中，攪拌均勻后，再放置于-16 _20°C溫度下，預凍3 6小時，接著再放置于冷凍干燥機中，在30 60 真空度、-50 _60°C溫度下，進行冷凍干燥M 36小時。
全文摘要
一種純化腈水解酶的制備方法，屬于腈水解酶的制備方法。本發明以市售粗腈水解酶為原料，經預處理、超濾分級、冷凍干燥的簡單工藝，制備出純化腈水解酶產品。本發明的方法簡單，使用常規的簡單設備，操作簡易控制，生產安全，便于推廣應用；在生產過程中，反應條件溫和，能耗低，充分利用物料資源，無排放，有利于環保；生產出的產品純度高，活性高，穩定性好，能滿足制備高附加值產品的要求。采用本發明制備出的產品可廣泛應用于醫藥、化工、材料、農業等行業中。
文檔編號C12N9/88GK102363775SQ20111038927
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月30日 優先權日2011年11月30日
發明者周興, 周小華, 康宏寬, 張 杰, 徐溢, 王丹, 王永紅 申請人:重慶大學