專利名稱：黃曲霉毒素b1核酸適體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及利用分子生物學技術----SELEX技術設計和制備一種與黃曲霉毒素Bl高特異性和高親和力結合的黃曲霉毒素Bl核酸適體及其應用。
背景技術：
黃曲霉毒素(AF)是一組化學組成相似的真菌毒素的總稱，屬二呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，包括毒素Bi、B2、GU G2等10多種，其中以黃曲霉毒素Bl存在量最大，毒性也最強，主要產生菌種是黃曲霉和寄生曲霉，最常見于花生及糧油等花生制品、玉米、大米、棉籽、一些堅果類食品和飼料、奶制品中。AF有強烈的毒性，按毒性級別分類，屬于超劇毒級， 其毒性是氰化鉀的10倍，是砒霜的68倍。其作用的主要靶器官為肝臟，急性中毒主要表現為肝臟損傷、肝實質細胞消失延遲、膽管增生、肝細胞脂質消失延遲和肝出血，慢性中毒主要表現為生長發育遲緩、肝臟出現亞急性或慢性損傷，并引起原發性肝細胞癌，已成為人類肝癌發病的重要因素，還可作用于如腎臟、胃、直腸、乳腺、卵巢等器官。包括中國在內的許多國家均制定了食品中AF允許量的國家標準。目前世界各國通用的AF檢測方法為薄層層析法、微柱法、高壓液相法等，這些方法均不同程度地存在操作繁瑣、效率低、對操作者、操作環境要求較高的缺點，酶聯免疫吸附法是國際公認的測定AF的先進方法，靈敏度高、干擾少、測定步驟簡便、快速、操作安全。 然而，對于AF這種毒性小分子，其抗體的制備周期長、生產成本高、技術難度大、批間差異大、克隆株(細胞)難以有效保存等難題，大大限制了酶聯免疫吸附法等免疫學檢測技術的快速發展。核酸適體(aptamer)作為一種特異性更好、親和力更高、品質均一、穩定性好的抗體替代品，在檢測分析領域中的應用已經被廣為認可，并具有開發周期短、生產成本低、 使用方便的特點，因此，核酸適體在AF這種毒性小分子的快速檢測中具有良好的應用前景，其高度特異性(具有對靶標分子單個取代基修飾的識別能力)更特別適合于AF這種結構類似物復雜的分子分析。
發明內容
本發明的目的在于提供一種采用新一代SELEX技術篩選得到的能夠與黃曲霉毒素Bl高特異性和高親和力結合的結構轉換信號適體，并提供黃曲霉毒素Bl核酸適體在黃曲霉毒素Bl檢測分析和樣品分離富集中的應用方法，具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適體具許多優勢。本發明的技術方案一種黃曲霉毒素Bl核酸適體，其特征在于它為核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGGGTAATCCTAAGCGGAACTGAGGAGTGGGAGGTAAATCGTGTGA AGTGCTGTCCC或其互補的核苷酸序列所示的DNA分子。所述一種黃曲霉毒素Bl核酸適體的衍生物具有相同功能用途。所述一種黃曲霉毒素Bl核酸適體的衍生物為核苷酸序列進行氨基化或巰基化或同位素化修飾所述一種黃曲霉毒素Bl核酸適體的衍生物為核苷酸序列結合生物素或酶或地高辛或熒光物質或納米發光材料。一種黃曲霉毒素Bl核酸適體的應用，其特征在于將黃曲霉毒素Bl核酸適體用于黃曲霉毒素Bl的檢測分析，它包括以下步驟(1)競爭板準備50μ g/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚賴氨酸100μ 1 于4°C包被過夜，交聯劑次亞苯基二異硫氰酸鹽或戊二醛活化Mi，200-20(K)pmOl/ml NH2-引物100 μ 1偶聯，0. 2mol/L乙醇胺或甘氨酸封閉2h，硼氫化鈉還原，1 % BSA封閉，PBS洗滌后備用；(2)檢測步驟①黃曲霉毒素Bl核酸適體5-10pmol，94°C 3min、冰上5min變性；②與O-IOOpmol靶標混勻，總體積100 μ 1，加入板中，室溫孵育30min ；③吸取50 μ 1加入熒光板中，加入1 200 OliGreen 100 μ 1，作用5min ；④測定熒光值(Ex:485nm, Em :525nm)。標準曲線通過6次重復試驗，以熒光數值為縱坐標，以標準濃度為橫坐標，做標準曲線。靈敏度計算通過6次重復試驗，檢測的標靶含量為Ong/ml 士 3*STDV。重復性標樣重復測定5次，計算其測定離散度CV值。回收率以玉米甲醇提取物稀釋50倍為樣品，加入低、中、高濃度標準，重復測定3 次，計算其回收率。AFBl檢測試劑盒檢測靈敏度0. lng/ml，重復性CV < 5%以玉米勻漿甲醇提取物為樣品1 50稀釋，回收率見表
加入量測定值(ng/ml)測定均值標準差回收率
(ng/ml)_(ng/ml)_(%)
2.02.12 2.22 1.962.100. 131 105.00
10. 0 10.12 10.43 11.2110.590.562 105.87
50. 0 48.60 49.04 48.4348.690.315 97.38一種黃曲霉毒素Bl核酸適體的應用，其特征在于將黃曲霉毒素Bl核酸適體用于從樣品中分離、富集黃曲霉毒素Bl，它包括以下步驟(1)將偶聯有黃曲霉毒素Bl核酸適體的磁顆粒與待分離的含黃曲霉毒素Bl的溶液充分混合；(2)用磁分離器富集磁顆粒，并清洗，然后將黃曲霉毒素Bl從偶聯有核酸適體的磁顆粒上解離，得到黃曲霉毒素Bl單組份。—種黃曲霉毒素Bl核酸適體的互補序列的應用，其特征在于用于黃曲霉毒素Bl 檢測分析中，它包括以下步驟①黃曲霉毒素Bl檢測層析試紙條，其基本結構組成包括支撐墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊等；②膠體金結合墊上含有核酸適體與其互補序列組裝的納米顆粒聚集體(經生物素標記)6 μ 1，硝酸纖維素膜上含有l-10mg/ml鏈霉親和素2 μ 1的檢測線；③檢測時，將試紙條吸收板端插入待測樣品的溶液中，約20s，液體完全濕潤連接板并進入膜，取出紙條，放在平臺上讓液體繼續流動，若待測液中無靶標，聚集體較大，不能隨液流進入硝酸纖維素膜，不顯色，若待測液中有靶標黃曲霉毒素Bl存在，可導致組裝的聚集體解離而形成分散的納米顆粒，分散的納米顆粒隨液流進入纖維素膜，納米顆粒上的生物素標記物與膜上鏈霉親和素結合，顯紅色，是為陽性結果，且顯色程度與靶標濃度呈正比關系。本發明一種黃曲霉毒素Bl核酸適體的特性評測1、熒光定量PCR法評價黃曲霉毒素Bl核酸適體的活性充分洗滌組裝(通過其互補序列實現)有黃曲霉毒素Bl核酸適體的磁顆粒， 然后用終濃度1 μ M的黃曲霉毒素Bl進行競爭，室溫反應30min。以競爭反應產物為模板進行熒光定量PCR反應，采用hvitrogen公司的試劑盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG, 20 μ 1體系中含模板2 μ 1、引物Ρ1、Ρ2各20pmol，退火溫度65°C。同時設置以溶劑甲醇作為競爭物的對照組。結果
_Ct 均值(n=3)實驗組11.8
甲醇對照組/可見黃曲霉毒素Bl核酸適體對黃曲霉毒素Bl具有特異性親和能力。2、染料法評價黃曲霉毒素Bl核酸適體的活性充分洗滌組裝(通過其互補序列實現)有黃曲霉毒素Bl核酸適體的磁顆粒，然后用終濃度ι μ M的黃曲霉毒素Bl進行競爭，室溫反應30min。Oligreen染料用結合緩沖液按1 200稀釋后，等比例加入競爭反應液中，室溫避光反應2-5min，用480nm光激發，測定 520nm處的發射光。同時設置以甲醇作為競爭物的對照組和結合緩沖液本底對照組。結果本底對照組未檢測到發射光，實驗組熒光強度顯著高于甲醇對照組，可見黃曲霉毒素Bl核酸適體對黃曲霉毒素Bl具有特異性親和能力。3、經基團修飾的黃曲霉毒素Bl核酸適體的活性評價 依熒光定量PCR法評價黃曲霉毒素Bl核酸適體的活性的方法，用熒光定量PCR法分別進行氨基化黃曲霉毒素Bl核酸適體、巰基化黃曲霉毒素Bl核酸適體、同位素化黃曲霉毒素Bl核酸適體、生物素標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體、HRP標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體、AP標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體、地高辛標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體、TAMRA標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體、以及納米發光材料ISiO5 = Eu標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體的活性評價。結果
5_Ct 均值(n=3)
氨基化黃曲霉毒素Bl核酸適體組 13. 2 巰基化黃曲霉毒素Bl核酸適體組 12. 7 同位素化黃曲霉毒素Bl核酸適體組 12. 4 生物素標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體組 11. 3 HRP標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體組 10. 8 AP標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體組 12. 5 地高辛標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體組 11. 1 TAMRA標記的黃曲霉毒素Bl核酸適體組_11.權利要求
1.一種黃曲霉毒素Bl核酸適體，其特征在于它為核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGC ATCGGGTAATCCTAAGCGGAACTGAGGAGTGGGAGGTAAATCGTGTGAAGTGCTGTCCC 或其互補的核苷酸序列所示的DNA分子。
2.根據權利要求1所述一種黃曲霉毒素Bl核酸適體，其特征在于與所述黃曲霉毒素 Bl核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列進行氨基化或巰基化或同位素化修飾。
3.根據權利要求1所述一種黃曲霉毒素Bl核酸適體，其特征在于與所述黃曲霉毒素 Bl核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列結合生物素或酶或地高辛或熒光物質或納米發光材料。
4.一種權利要求1所述黃曲霉毒素Bl核酸適體的應用，其特征在于用于黃曲霉毒素 Bl的檢測分析。
5.一種權利要求1所述黃曲霉毒素Bl核酸適體的應用，其特征在于用于從樣品中分離、富集黃曲霉毒素Bi。
6.一種權利要求2或3所述黃曲霉毒素Bl核酸適體衍生物的應用，其特征在于應用于黃曲霉毒素Bl檢測分析和分離富集中。
全文摘要
本發明涉及一種與黃曲霉毒素B1高特異性和高親和力結合的核酸適體及其應用，該核酸適體可以用于黃曲霉毒素B1的檢測分析和分離富集，具有特異性好、親和力高、品質均一、穩定性好、開發周期短、生產成本低、使用方便的特點。本發明還涉及所述核酸適體序列的衍生序列，包括修飾后的序列。
文檔編號C12N15/115GK102517289SQ20111038034
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者吳淑慶, 張良, 楊在明 申請人:國家納米技術與工程研究院