專利名稱：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及利用分子生物學技術----SELEX技術設計和制備一種與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇高特異性和高親和力結合的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體及其應用。
背景技術：
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又稱嘔吐毒素，是一種B型單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產生，多分布于小麥、大麥、玉米等谷物籽實中，也污染糧食制品。它對谷物污染率和污染水平居于鐮刀菌毒素之首，不僅在赤霉病發展過程中具有重要作用，而且對人畜可以產生廣泛的毒性效應，屬于劇毒或中等毒物，可致嘔吐、腹瀉、發燒等急性中毒癥狀，與貧血、免疫抑制、食管癌、克山病也具有密切聯系，另外，它還常與其它的霉鹵毒素如黃曲霉毒素共同污染農作物，進入人體后可以相互影響。因此監控DON的含量意義重大。DON的檢測可用多種不同的方法，如薄層色譜、酶聯免疫、氣相色譜、液相色譜、近紅外光譜分析、熒光極性免疫分析等，其中酶聯免疫法(ELISA)以快速、方便、預處理過程簡捷占優，但其仍存在一定的問題。ELISA的主要缺點在于DON高效、特異的單抗或多抗制備工藝復雜，所用抗體普遍存在與DON的乙酰化類似物的交叉反應，使其檢出值偏高，易出現假陽性；有些檢測方法索性用較靈敏的3，5，7_三乙酰化DON免疫產生的抗體替代DON抗體，但這不但要求分析前對提取物進行乙酰化處理，而且檢測出的為3 — AcD0N、15-AcD0N 和3，15-AcD0N混合物的量。可以說，對于DON種毒性小分子，其抗體的制備周期長、生產成本高、技術難度大、批間差異大、克隆株(細胞)難以有效保存等難題，大大限制了酶聯免疫吸附法等免疫學檢測技術的快速發展。核酸適體(aptamer)是一種比抗體具有更高特異性的配基，甚至能識別單抗所不能區分的靶標分子單個取代基修飾的極細微差別，其作為一種特異性更好、親和力更高、品質均一、穩定性好的抗體替代品，在檢測分析領域中的應用已經被廣為認可，并具有開發周期短、生產成本低、使用方便的特點，因此，核酸適體在DON 這種擁有復雜結構類似物的毒性小分子的快速檢測中具有良好的應用前景。
發明內容
本發明的目的在于提供一種采用新一代SELEX技術篩選得到的能夠與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇高特異性和高親和力結合的結構轉換信號適體，并提供脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體在脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測分析和樣品分離富集中的應用方法，具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適體具許多優勢。本發明的技術方案一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體，其特征在于為核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互補的核苷酸序所示的DNA分子。所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的衍生物具有相同功能用途。所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的衍生物為核苷酸序列進行氨基化或巰基化或同位素化修飾。所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的衍生物為核苷酸序列結合生物素或酶或地高辛或熒光物質或納米發光材料。一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的應用，其特征在于將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測分析，它包括以下步驟(1)競爭板準備50μ g/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚賴氨酸100μ 1 于4°C包被過夜，交聯劑次亞苯基二異硫氰酸鹽或戊二醛活化Mi，200-20(K)pmOl/ml NH2-引物100 μ 1偶聯，0. 2mol/L乙醇胺或甘氨酸封閉2h，硼氫化鈉還原，1 % BSA封閉，PBS洗滌后備用；(2)檢測步驟①脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體5-10pmol，94°C 3min、冰上5min變性；②與O-IOOpmol靶標混勻，總體積100 μ 1，加入板中，室溫孵育30min ；③吸取50 μ 1加入熒光板中，加入1 20001iGreen 100 μ 1，作用5min ；④測定熒光值(Ex:485nm, Em :525nm)。標準曲線通過6次重復試驗，以熒光數值為縱坐標，以標準濃度為橫坐標，做標準曲線。靈敏度計算通過6次重復試驗，檢測的標靶含量為Ong/ml 士 3*STDV。重復性標樣重復測定5次，計算其測定離散度CV值。回收率以玉米甲醇提取物稀釋50倍為樣品，加入低、中、高濃度標準，重復測定3 次，計算其回收率。DON檢測試劑盒檢測靈敏度0. 13ng/ml，重復性-XN <7%以玉米勻漿甲醇提取物為樣品1 50稀釋，回收率見表
加入量測定值(ng/ml)測定均值標準差回收率
(ng/ml)(ng/ml)(%)
2.01.852.161. 971. 990.15699.6710.,010.,3410.2111. 2210. 590.549105,.9050.,049.,4248.2148. 1348. 590.72397.17一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的應用，其特征在于將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體用于從樣品中分離、富集脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，它包括以下步驟(1)將偶聯有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的磁顆粒與待分離的含脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的溶液充分混合；(2)用磁分離器富集磁顆粒，并清洗，然后將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇從偶聯有核酸適體的磁顆粒上解離，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單組份。—種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的互補序列的應用，其特征在于應用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測分析中，它包括以下步驟①脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測層析試紙條，其基本結構組成包括支撐墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊等；②膠體金結合墊上含有核酸適體與其互補序列組裝的納米顆粒聚集體(經生物素標記)6 μ 1，硝酸纖維素膜上含有l-10mg/ml鏈霉親和素2 μ 1的檢測線；③檢測時，將試紙條吸收板端插入待測樣品的溶液中，約20s，液體完全濕潤連接板并進入膜，取出紙條，放在平臺上讓液體繼續流動，若待測液中無靶標，聚集體較大，不能隨液流進入硝酸纖維素膜，不顯色，若待測液中有靶標脫氧雪腐鐮刀菌烯醇存在，可導致組裝的聚集體解離而形成分散的納米顆粒，分散的納米顆粒隨液流進入纖維素膜，納米顆粒上的生物素標記物與膜上鏈霉親和素結合，顯紅色，是為陽性結果，且顯色程度與靶標濃度呈正比關系。本發明一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的特性評測1、熒光定量PCR法評價脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的活性充分洗滌組裝(通過其互補序列實現)有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的磁顆粒，然后用終濃度1 μ M的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行競爭，室溫反應30min。以競爭反應產物為模板進行熒光定量PCR反應，采用hvitrogen公司的試劑盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG, 20 μ 1體系中含模板2 μ 1、引物Ρ1、Ρ2各20pmol，退火溫度65°C。同時設置以溶劑甲醇作為競爭物的對照組。結果
權利要求
1.一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體，其特征在于為核苷酸序列 GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互補的核苷酸序列所示的DNA分子。
2.根據權利要求1所述一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體，其特征在于與所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列進行氨基化或巰基化或同位素化修飾。
3.根據權利要求1所述一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體，其特征在于與所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列結合生物素或酶或地高辛或熒光物質或納米發光材料。
4.一種權利要求1所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的應用，其特征在于用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測分析。
5.一種權利要求1所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體的應用，其特征在于用于從樣品中分離、富集脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。
6.一種權利要求2或3所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體衍生物的應用，其特征在于應用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測分析和分離富集中。
全文摘要
本發明涉及一種與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇高特異性和高親和力結合的核酸適體及其應用，該核酸適體可以用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測分析和分離富集，具有特異性好、親和力高、品質均一、穩定性好、開發周期短、生產成本低、使用方便的特點。本發明還涉及所述核酸適體序列的衍生序列，包括修飾后的序列。
文檔編號C12Q1/68GK102559686SQ20111038011
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者劉海霞, 劉雅文, 吳淑慶 申請人:國家納米技術與工程研究院