專利名稱：女性妊娠期高血壓基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種女性妊娠期高血壓的基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估女性妊娠期高血壓發生的風險級別，并且指導妊高癥高危人群提早預防和治療。
背景技術：
妊娠期高血壓疾病是妊娠期所特有的疾病。流行病學調查顯示，約9. 4%孕婦發生不同程度的妊高征。本病發生于妊娠20周以后，臨床表現為高血壓、蛋白尿、浮腫，嚴重時出現抽搐、昏迷，甚至母嬰死亡。迄今為止，妊娠期高血壓仍為孕產婦及圍生兒死亡的重要原因。眾多研究發現，該疾病具有較高的遺傳傾向，通過分子診斷檢測與妊娠期高血壓發生密切相關的基因位點就可以提前評估受檢者患妊娠期高血壓的風險，提早預防和治療。例如編碼血管緊張素轉換酶的基因ACE與女性妊娠期高血壓疾病發生密切相關。國內外的臨床研究數據顯示，ACE基因I/D位點多態性影響著血管緊張素轉換酶的活性，因此除了與妊娠期高血壓的發生密切相關外，還可以作為冠心病、心肌病、高血壓等多種圍產期疾病發生的獨立危險因素。2006年，陳柏坤等人對92例妊娠期高血壓患者和85例正常妊娠者的ACE基因多態性進行研究，最終結果表明，妊娠期高血壓患病組ACE基因I/D位點基因型分布頻率分別為II型21.7%、ID型33. 7%、DD型44. 6% ；對照組ACE基因I/D位點基因型分布頻率分別為II型41. 2%、ID型40. 0%、DD型18. 8%，并且對照組和妊娠期高血壓患病組的DD基因型頻率比較有顯著性差異，因此，ACE基因的DD基因型可能是妊娠期高血壓發病的重要遺傳因素之一。同樣的原理，MTHFR基因的TT基因型、AGTRl基因的CC基因型、N0S3基因的TT基因型可以作為妊娠期高血壓發病的獨立危險因素進行基因檢測。因此，建立簡單、快速的女性妊娠期高血壓易感基因無創檢測方法，能夠檢測出女性在與妊娠期高血壓疾病發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患妊娠期高血壓的女性高危人群，有針對性的進行孕期檢測和指導，對于降低孕產婦死亡、圍產兒死亡以及病殘兒的發生、保障母嬰安全健康具有非常重要的意義。
發明內容
基于ACE 基因上 I/D(rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、AGTRl 基因上A1166C(rs5186)、N0S3基因上G894T (rsl79998;3)的4個單核苷酸多態性位點基因型可用來評估女性妊娠期高血壓發病風險級別，本發明提供一種女性妊娠期高血壓基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測ACE 基因上 I/D(rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、AGTRl 基因上A1166C(rs5186)、N0S3基因上G894T (rsl799983)的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；
PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ；125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1.檢測試劑盒的使用1、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(1) ACE (I /D)正向引物5 ‘ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3 ‘ACE (I/D)反向引物5 ‘ ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3 ‘(2) MTHFR (C677T)正向引物5 ‘ CATCCCTCGCCTTGAACAG 3 ‘MTHFR (C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT 3 ‘(3) AGTRl (Al 166C)正向引物5 ‘ AAAGCCAAATCCCACTCAAAC3 ‘AGTR1(A1166C)反向引物5' GAGCAGCCGTCATCTGTCTAA3‘(4) N0S3 (G894T)正向引物5 ‘ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3 ‘N0S3 (G894T)反向引物5 ‘ CCTCACCTCCAGGATGTTGT3 ‘PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq酶0. 125 μ 1、DNA模板 1 μ 1 (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C 1分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化
使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(1) ACE (I /D)測序引物5 ‘ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3 ‘(2)MTHFR(C677T)測序引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'C3)AGTR1(A1166C)測序引物5' AAAGCCAAATCCCACTCAAAC3‘
(4) N0S3 (G894T)測序引物5 ‘ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3 ‘反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測序引物lul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的轉速離心30min，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min離心15min，輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.為女性進行預防妊娠期高血壓基因無創檢測的服務1.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的ACE基因上I/D(rs4646994)、 MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、AGTRl 基因上 A1166C(rs5186)、N0S3 基因上 G894T (rsl799983)的4個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這4個SNPs位點的基因型。3.妊娠期高血壓高危人群風險評估分析通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具妊娠期高血壓風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者 ACE 基因上 I/D(rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133) ,AGTRl 基因上A1166C(rs5186)、N0S3基因上G894T(rsl799983)的SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀女性妊娠期高血壓基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種篩查女性妊娠期高血壓高危人群的基因無創檢測試劑盒，其特征在于 檢測 ACE 基因上 I/D (rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、AGTRl 基因上 A1166C(rs5186)、N0S3基因上G894T(rsl799983)的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、Exo I酶、B i gDye mi χ、 EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對ACE基因上 I/D(rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、AGTRl 基因上 A1166C(rs5186)、 N0S3基因上G894T(rsl79998;3)的4個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這4個 SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對ACE基因上 I/D(rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133) ,AGTRl 基因上 A1166C(rs5186)、N0S3 基因上G894T (rsl799983)的4個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述4個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的4對特異性引物序列如下(1)ACE (I /D)正向引物5 ‘ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3 ‘ACE (I/D)反向引物5 ‘ ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3 ‘(2)MTHFR (C677T)正向引物5 ‘ CATCCCTCGCCTTGAACAG 3 ‘MTHFR (C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT 3 ‘(3)AGTRl (Al 166C)正向引物5 ‘ AAAGCCAAATCCCACTCAAAC3 ‘AGTRl (Al 166C)反向引物5 ‘ GAGCAGCCGTCATCTGTCTAA3 ‘(4)N0S3 (G894T)正向引物5 ‘ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3 ‘N0S3 (G894T)反向引物5 ‘ CCTCACCTCCAGGATGTTGT3 ‘
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的4條DNA測序引物序列如下(1)ACE (I /D)測序引物5 ‘ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3 ‘(2)MTHFR(C677T)測序引物5'CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'(3)AGTRl (Al 166C)測序引物5 ‘ AAAGCCAAATCCCACTCAAAC3 ‘(4)N0S3 (G894T)測序引物5 ‘ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3 ‘
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)PCR反應體系10XPCR反應緩沖液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 測序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測女性妊娠期高血壓基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測ACE基因上I/D(rs4646994)、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、AGTR1基因上A1166C(rs5186)、NOS3基因上G894T(rs1799983)的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與圍產期女性妊娠期高血壓發生密切相關的4個單核苷酸多態性位點的基因型從基因層面來評估女性妊娠期高血壓發病的風險級別，指導圍產期女性提早預防妊娠期高血壓疾病的發生。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102373285SQ20111037915
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月23日 優先權日2011年11月23日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司