專利名稱：糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及糖尿病動脈粥樣硬化疾病的治療領域，更具體地講，涉及糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA及其應用。
背景技術：
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病目前仍然是西方社會位居首位的死亡原因。內皮損傷是動脈粥樣硬化進程的首要步驟[1’2]。而機體損傷的內皮單層可以通過骨髓來源的內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)分化為內皮細胞而再生。EPC通過提高血管再內皮化形成，限制了動脈粥樣硬化的發生發展[3]，因此EPC功能損傷是動脈粥樣硬化的始發主要環節之一 M。眾所周知糖尿病能促進冠狀動脈粥樣硬化的發生和發展，而心血管并發癥是糖尿病患者死亡的主要原因b]。現階段，相關研究已發現糖尿病機體EPC數量下降和功能降低是加快糖尿病患者動脈粥樣硬化進程的原因之一 [6]。針對糖尿病EPC的研究發現，糖尿病EPC功能損傷與糖尿病EPC表達的相關基因和蛋白的上調和下調有關[7_9]。但是，一方面高糖刺激下的EPC的基因和蛋白變化涉及細胞代謝、細胞循環和氧壓反應等多個方面[7]；另一方面，EPC內皮修復功能的實現需通過多個途徑的合作，包括 EPC “歸巢”至血管生長活躍位置，粘附至活化或損傷的內皮細胞或細胞外基質，參與局部活化內皮細胞和/或分化成為成熟的內皮細胞，并整合至損傷的血管[1°]。因此，若僅通過改變糖尿病EPC上一種基因或蛋白表達來抑制其功能損傷可能存在一定的局限性。隨著近年來對miRNA呈爆發式增長的研究，我們知道一種miRNA在細胞內靶基因可有上百種，miRNA調控的靶基因包括轉錄因子、信號蛋白、腳手架蛋白、代謝酶等，而這些分子在生物網絡中，如基因調控網、細胞信號轉導網、蛋白質相互作用網以及代謝網中都具有核心作用，因此miRNA通過轉錄后水平調控這些分子廣泛參與了細胞內各種生物功能 [11_13]。由此可見，糖尿病EPC上可能有大量的基因受miRNA的調控。新近研究發現了糖尿病患者的血清中存在相關miRNA表達水平的降低[14]，但是針對糖尿病EPC功能損傷相關 miRNA的研究，尚未見相關報道。參考文獻如下。1、Lerman A and Zeiher AM. Endothelial function :cardiac events. Circulation,2005,111 :363_368。2、Libby P, Ridker PM and Maseri A. Inflammation and atheroslerosis. Circulation,2002,105 :1135_1143。3、Ishida A, Ohya Y, Sakuda H, et al. Autologous peripheral blood mononuclear cell implantation for patients with peripheral arterial disease improves limb ischemia. Circ J. 2005,69 :1260-1265。4、Kosuge M, Kimura K, Kojima S, et al. Effects of glucose abnormalities on in—hospital outcome after coronary intervention for acute myocardialinfarction. Circ J. 2005,69 :375_379。5>Sodha NR,Clements RT,Boodhwani Μ,et al. Endostatin and angiostatin are increased in diabetic patients with coronary artery disease and associated with impaired coronary collateral formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009, 296 :H428-434o6>Sambuceti G,MorbelIi S,Vanella L, et al. Diabetes impairs the vascular recruitment of normal stem cells by oxidant damage ；reversed by increases in PAMPK, Heme Oxygenase-I and Adiponectin. Stem Cells, 2009，27 :399_407。7、Balestrieri ML, Rienzo M, Felice F, et al. High glucose downregulates endothelial progenitor cell number via SIRTLBiochim Biophys Acta. 2008,1784 936-945。8、Di Stefano V, Cencioni C, Zaccagnini G, et al. p66ShcA modulates oxidative stress and survival of endothelial progenitor cells in response to high glucose. Cardiovasc Res. 2009，82 :421_429。9、Kuki S, Imanishi T, Kobayash i K, e t al. Hyperglycemia acceleratedendotheIial progenitor cell senescence via the activation of p38mitogen-activated protein kinase. Circ J. 2006, 70 :1076-1081。10、Real C, Caiado F, Dias S. Endothelial progenitors in vascular repair and angiogenesis :how many are needed what to do ？ Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2008,8 :185-193。IKAguda BD, Kim Y, Piper-Hunter MG, et al. MicroRNA regulation of a cancer network :consequences of the feedback loops involving miR-17—92, E2F, and Myc. Proc Natl AcadSci U S A. 2008，105 :19678-19683。12、Xiao C, Rajewsky K. MicroRNA control in the immune system :basic principles. Cell. 2009，136 :26_36。13、0’ Hara SP, Mott JL, Splinter PL, et al. MicroRNAs :key modulators of posttranscriptional gene expression. Gastroenterology. 2009,136 :17_25。14、Zampetaki A, Drozdov I, Willeit P, et al. Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR—126 and other microRNAs in type 2diabetes. Circ Res,2010,107 :810_817。
發明內容
本發明的目的在于提供一組糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA。本發明的第二個目的是提供糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA在改變內皮祖細胞血管生成能力中的應用。本發明的第三個目的是提供糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA在制備防治糖尿病動脈粥樣硬化疾病藥物中的應用。為實現以上目的，本發明公開以下技術方案一組糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的 microRNA，所述 microRNA 為 hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-U6 和
4hsa_miR-130ao上述糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA在改變內皮祖細胞血管生成能力中的應用，所述改變是指下調內皮祖細胞上所述microRNA表達將導致內皮祖細胞克隆形成能力降低，內皮祖細胞凋亡水平增加，從而降低內皮祖細胞的血管生成能力；恢復內皮祖細胞上所述microRNA的表達將促進內皮祖細胞上血管生成能力。上述糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA在制備防治糖尿病動脈粥樣硬化疾病藥物中的應用。糖尿病動脈粥樣硬化疾病主要指糖尿病引起的大動脈粥樣硬化病，主要包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。按照如下方法篩選出滿足本發明目的的microRNA (1)體外收集年齡、性別匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者外周血，磁珠分選EPC ； (2)應用microarray analysis技術， 體外檢測糖尿病EPC miRNAs表達的差異，篩選出參與糖尿病EPC功能損傷的miRNAs ； (3) 用tagman探針熒光定量PCR驗證，然后用數據庫及計算機軟件分析并篩選出miRNAs所對應的靶mRNA。(4)體外檢測所篩選出的miRNAs對EPC功能的影響。hsa-miR-21、hsa_miR-27a、hsa_miR-27b、hsa-miR-126 和 hsa_miR-130a 在糖尿病患者的EPC中表達明顯下調，EPC中該組microRNA表達不足將導致EPC克隆形成能力降低，EPC凋亡水平增加，從而降低EPC的血管生成能力。因此hsa-miR-21、hsa-miR-27a、 hsa-miR-27b,hsa-miR-126 和 hsa_miR-130a 是糖尿病 EPC 功能損傷相關的 microRNA，恢復糖尿病患者 EPC 上 hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-U6 和 hsa_miR-130a 的表達將促進其血管生成能力，從而預防和治療糖尿病動脈粥樣硬化的發生、發展。基于以上研究，本發明提出將 hsa-miR-21、hsa_miR-27a、hsa_miR-27b、hsa-miR-126 和 hSa-miR-130a用于制備預防、治療糖尿病動脈粥樣硬化疾病藥物中的應用。本發明的優點在于通過體外收集年齡、性別匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者外周血，經磁珠分選EPC，結合microarray analysis技術，體外檢測EPCmiRNAs表達的差異，篩選出可能參與糖尿病EPC功能損傷的miRNAs，然后用tagman探針熒光定量PCR驗證， 用數據庫及計算機軟件分析并預測篩選出miRNAs所對應的可能靶mRNA，并體外檢測所篩選出的miRNAs對EPC功能的影響，最大程度篩選出糖尿病EPC功能損傷的miRNA，進一步完善糖尿病動脈粥樣硬化的形成機制，并為糖尿病動脈粥樣硬化的防治開辟新的治療靶點和方法。
圖1為miRNA質控結果電泳圖，其中，圖1_1為1 % agrose膠電泳總RNA，圖1_2 為Agilent 2100分析得到的完整的總RNA。圖2為年齡、性別匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者EPC基因芯片篩選Cy3/Cy5 信號圖，其中圖2-1為糖尿病患者Cy3，圖2-2為糖尿病患者Cy5。圖3為芯片分析結果，非糖尿病組(Value2)相比糖尿病組(valuel)變化超過10 倍以上，且值均大于5的miRNA，淺色部分為Q-PCR的進一步驗證microrna。圖4為taqman探針熒光定量PCR驗證芯片結果圖，與糖尿病組相比*卞< 0.01， *P < 0. 05。
圖 5 為 EPC 轉染 anti-miR-21、anti_miR-27a、anti_miR-27b、anti-miR-126, anti-miR-130a 后，miR-21、miR_27a、miR_27b、miR-126、miR_130a 表達顯著下調。圖 6 為 EPC 轉染 anti-miR-21、anti_miR-27a、anti_miR-27b、anti-miR-126, anti-miR-130a后對其克隆形成功能的影響。圖 7 為 EPC 轉染 anti-miR-21、anti_miR-27a、anti_miR-27b、anti-miR-126, anti-miR-130a后對其凋亡功能的影響。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做詳細說明，實施例的作用僅是解釋而非限定本發明。實施例1、與糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA的篩選方法步驟一、體外收集年齡、性別匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者外周血，磁珠分選 EPC，并表型、純度鑒定。1、研究對象本研究按照年齡、性別匹配分為糖尿病患者組和非糖尿病患者組， 其中，糖尿病患者15例，非糖尿病患者15例，按知情同意原則，每例患者均抽取外周血 15ml。糖尿病患者入選標準(WH01999診斷標準)①糖尿病癥狀及任意時間血漿葡萄糖水平> 11. lmmol/L(200mg/dl)或②空腹血漿葡萄糖(FPG)水平彡 7. Ommol/L(126mg/dl)或 ③0GTT( 口服葡萄糖耐量試驗)中，2小時血糖水平彡11. lmmol/U200mg/dl)。兩組患者都排除嚴重感染，嚴重肝腎疾患及心功能不全，酮癥酸中毒以及甲狀腺功能異常者。2、人外周血EPC分離、表型、純度鑒定本研究采用磁珠分選人外周血內皮祖細胞 (⑶133+)。首先使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法，分離正常成人及糖尿病人外周血單個核細胞，再加入抗人P3-⑶133+單克隆抗體(依據美天旎抗體說明書，貨號130-080-801) 標記CD133+細胞anti-PE磁珠(MiltenyiBiotech，130-048-801)孵育，通過分離柱收集 ⑶133+細胞，離心收集細胞沉淀計數，5*105細胞/30ml。流式細胞儀檢測檢測⑶133+細胞陽性率大于90%以上。步驟二、應用microarray analysis技術，體外檢測糖尿病EPC miRNAs表達的差已升。1、總RNA提取，小RNA富集及質控。用TRIzol (SIGMA)方法提取總RNA。總RNA質量檢測①瓊脂糖膠電泳方法，通過目測28S和18S的亮度比例可以初步評價總RNA的質量，實驗結果顯示(圖 1-1) 28S 18S彡2可以初步判定總RNA質量較好。②Lab-on-chip方法，參照Agilent 2100分析儀操作手冊，制備凝膠，按照軟件提示進行RNA電泳操作，顯示得到完整的總 RNA (圖1-2)。按照說明書步驟使用QIAGEN RNeasy Kit純化總RNA。2> microarray analysis ^iIlJ EPC microrna ^: !!胃。樣品制備將獲取的RNA樣本逆轉錄成cDNA，在cDNA中加入Cy3/Cy5熒光并轉錄生成cRNA，合成熒光標記cRNA。根據說明書使用QIAGEN RNeasy Mini Kit純化熒光探針，計算探針濃度及插入率。雜交檢測與數據處理用純化所得的樣品與芯片雜交、洗滌后通過使用Agilent Scanner來獲取圖像(圖幻，使用!Mature Extraction圖像分析軟進行定量分析并對圖像進行數字化轉換。通過設定熒光、背景和標準化方式(Linear&Lowess)參數，一步完成圖像定量和數據標準化處理，最后以列表等形式輸出包括熒光信號、背景信號、標準化后熒光信號與LogRatio值(兩種熒光cy3與cy5比值的對數值)參數。數據結果分析ratio值在0.5-2. O范圍內的基因不存在顯著的表達差異，而在該范圍之外的基因則被認為表達出現顯著改變。根據芯片分析結果比較糖尿病患者和非糖尿病兩組患者EPCs中microrna變化超過10倍以上，且值均大于5的miRNA共105個(圖 3-1，圖3-2，表3)。實驗重復3次。步驟三、檢測證實miRNAs的差異表達并預測相應miRNAs可能的靶mRNA。根據文獻以及生物信息技術將由芯片篩選出的差異最為顯著的5個miRNA，進行焚光定量 PCR 驗證(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-TimePCR System)。1、cDNA合成將糖尿病患者和非糖尿病患者的樣品RNA進行逆轉錄生成cDNA， 使用 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems),按說明書配 15 μ L反應體系，設置循環參數16°C 30分鐘，42°C 30分鐘，85°C 5分鐘，終止溫度4°C。2、Q-PCR分析RT產物，Taqman 2X通用PCR Master Mix和含由引物和特異探針的 5X MicroRNA Assay Mix (Applied Biosystems)配制 20-μ L 反應體系進行擴增，設置循環參數95°C 10分鐘，95°C 15秒變性退火擴增60°C 60秒，40個循環，重復3次。3、實驗結果綜合實驗設計和芯片結果挑選出5個最有意義的miRNA行熒光定量PCR驗證，驗證結果與芯片篩選完全吻合，原始CT值經過統計學處理，顯示miR-21， miR-27a, miR27_b，miR-126, miR-130a 在糖尿病患者中顯著減少(圖 4)，T-TEST 和 2way ANOVE 分析 P 值均小于 0. 05，有顯著性差異(表 1)。miR-21, miR_27a，miR27_b，miR-126, miR-130a是糖尿病EPC功能損傷相關miRNA。經文獻檢索出miR-21，miR-27a, miR27_b， miR-126, miR-130a均參與了血管生成調控，其中miR-21與miR-U6在糖尿病中有相關報道且變化趨勢基本一致，miR-27a與文獻報道的糖尿病中的趨勢相反，miR_27b和miR-130a 沒有在糖尿病相關模型中報道過。表1 表達差異最為顯著5個microrna
權利要求
1.一組糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA，其特征在于，所述microRNA為 hsa-miR-21、hsa_miR-27a、hsa_miR-27b、hsa-miR-126 禾口 hsa_miR-130ao
2.權利要求1所述的microRNA在改變內皮祖細胞血管生成能力中的應用，其特征在于，所述改變是指下調內皮祖細胞上所述microRNA表達將導致內皮祖細胞克隆形成能力降低，內皮祖細胞凋亡水平增加，從而降低內皮祖細胞的血管生成能力；恢復內皮祖細胞上所述microRNA的表達將促進內皮祖細胞上血管生成能力。
3.權利要求1所述的microRNA在制備防治糖尿病動脈粥樣硬化疾病藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述糖尿病動脈粥樣硬化疾病是指冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。
全文摘要
本發明公開一組糖尿病內皮祖細胞功能損傷相關的microRNA及其在改變內皮祖細胞血管生成能力中的應用和在制備防治糖尿病動脈粥樣硬化疾病藥物中的應用，所述microRNA為hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a。本發明完善了糖尿病動脈粥樣硬化的形成機制，并為糖尿病動脈粥樣硬化的防治開辟了新的治療靶點。
文檔編號C12N15/113GK102373210SQ20111036697
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年1月28日
發明者孟舒, 張小平, 王長謙 申請人:上海交通大學醫學院附屬新華醫院