專利名稱：檢測原鈣粘蛋白基因簇γ的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術領域的檢測基因簇的方法及試劑盒，具體涉及一種檢測檢測原鈣粘蛋白基因簇Y的方法及試劑盒。
背景技術：
大腦是一個由大量分化的神經元組成的復雜的神經系統，各個神經元通過基因的差異性表達表現出不同的特性。原鈣粘蛋白(pcdh)超家族成員是一類鈣粘素跨膜蛋白， 廣泛存在于脊椎動物的中樞神經系統中，是神經元多樣化形成的一個重要候選基因。pcdh 基因家族包括pcdh-α，- β，和-γ三個基因簇。研究表明，在單個蒲肯野細胞中，RT-PCR 分析顯示每個細胞是通過組合轉錄的方式單等位基因差異性表達pcdh-α，pcdh-γ Α，和 pcdh-γ B，每個等位基因上僅有一或兩個第一可變外顯子順式剪切到3’恒定區(constant region)外顯子上，而pcdh-α Cl，- α C2，- γ C3，- γ C4，- γ C5則是雙等位基因轉錄。所以， 可通過檢測pcdh-α和-Υ的基因簇來辨別神經細胞類型。原鈣粘蛋白基因在神經元分化以及突觸發生的過程中起著重要作用，而該過程已被證明與精神分裂癥(SZ)和雙向障礙癥(BD)的形成密切相關，同時，多個全基因組關聯性分析研究也顯示5q31連鎖的P⑶H家族是SZ和BD候選基因；目前，研究表明，P⑶H基因簇的長片段表觀沉默是Wilms’腫瘤疾病形成的主要原因，P⑶Hs通過負調控經典Wnt信號通路，抑制癌細胞的生長，最終發揮腫瘤抑制因子的作用。可見，PCDHs在發育和致病過程中起著非常重要的作用，通過檢測某種疾病相關組織PCDH基因的基因簇，可實現疾病診斷的目的。因此，找到一種能有效檢測組織或細胞PCDHG基因簇的方法，對揭示原鈣粘蛋白基因簇的功能和表達機制，并對進一步闡述神經元細胞多樣性發生的分子機制以及神經和腫瘤疾病的發病機制和疾病預測有非常重要的指導意義。人P⑶HG基因簇內包含22個串聯的第一可變外顯子和3個恒定外顯子，前者負責編碼六個胞外(EC)鈣粘素重復結構域，一個跨膜結構域和部分胞質(CP)結構域，后者負責編碼剩余的胞質結構域，通過選擇性剪切到恒定外顯子的方式形成22個PCDHG基因，可分為P⑶HGA，P⑶HGB，和P⑶HGC3，C4，C5三大類。22個基因N端的同源性較高，這就使得通常的引物設計顯得繁瑣復雜，特異性較差，并且無法正確反映PCDHG基因轉錄表達的真實狀態。
發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測原鈣粘蛋白基因簇Y的方法及試劑盒。本發明的方法能夠快速特異性檢測人組織或細胞內的PCDHG基因簇，本發明的方法首先抽提出組織或細胞內的總RNA，通過反轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增目的片段。本發明包含的PCR引物是四套各具有一個共同反向引物，位于第三個恒定外顯子內，通過在22個可變外顯子編碼區內分別設計22個特異性正向引物，由于RT-PCR后產生的擴增片段大小不同，通過產物片段長度的差異來將22個基因進行區分。
本發明是通過以下的技術方案實現的，第一方面，本發明涉及一種檢測原鈣粘蛋白基因簇Y的方法，包括如下步驟(a)抽提出組織或細胞內的總RNA，反轉錄獲得cDNA ；(b)以cDNA為模板，PCR擴增目的片段；(c)通過檢測PCR擴增產物，得到原鈣粘蛋白基因簇γ的22個基因的表達情況。優選地，所述PCR擴增采用的引物組選自以下4組引物組中的一種，所述4組引物組具有相同的正向引物，所述正向引物包括22條DNA寡核苷酸，所述22條DNA寡核苷酸的序列分別如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 22所示；所述4組引物組的反向引物分別如SEQ ID NO. 23-SEQ ID NO. 26 所示。優選地，所述PCR擴增的參數為預變性95°C，2分鐘；變性95°C，30秒，退火60°C， 30秒；延伸72°C，1分鐘；終末延伸72°C，7分鐘；共40個循環。第二方面，本發明還涉及一種檢測原鈣粘蛋白基因簇Y的試劑盒，所述試劑盒包括以下4種引物組中的一種或多種，所述4組引物組具有相同的正向引物，所述正向引物包括22條DNA寡核苷酸，所述22條DNA寡核苷酸的序列分別如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 22 所示；所述4組引物組的反向引物分別如SEQ ID NO. 23-SEQ ID NO. 26所示。本發明具有如下的有益效果本發明的檢測原鈣粘蛋白基因簇Y的方法能夠快速檢測原鈣粘蛋白基因簇，能夠實現快速準確檢測人類各個組織或細胞內原鈣粘蛋白 Y (P⑶HG)基因簇22種P⑶HG基因中每種基因的表達狀態，并且可對特異性表達的P⑶HG 基因的表達水平進行半定量分析，本發明的方法中涉及到的4種引物組能夠用于檢測人類原鈣粘蛋白基因簇的試劑盒的開發，具有非常實用的商業價值。
圖1為PCDHG基因簇結構示意圖及PCR引物的相對位置示意圖；每個長方形代表一個外顯子，下方的小箭頭代表23個PCR引物(22個正向引物，1個反向引物)在該基因簇中的相對位置。圖2為22個基因中第一個可變外顯子DNA序列比對圖；黑色區域表示相同的核苷酸序列區域，顏色越深表示該位置同源性越強。圖3為人大腦皮層源癌旁組織中22個POTHG基因(分別使用各自正向引物和4 個待選反向通用引物)的RT-PCR電泳對比圖及該組織中的PCDHG基因表達簇。圖4為PCDHG基因簇在細胞HEC-l-B (H)和SK-N_SH(Q中的基因表達簇。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例首先，通過DNAMAN軟件分析22個基因N端編碼區的序列同源性，在各個基因中找出同源性較低的序列區作為正向引物的候選區；在22個基因共有的C端編碼區中尋找反向通用引物；所述PCDHG基因簇的序列信息為NG_000012。依據以下引物設計原則尋找特異性引物(1)用重復序列去除(i^peat masker)軟件去掉候選序列中的冗余序列；(2)引物長度22bp左右；(3) GC含量接近于5O % ；(4)引物3’端最好選擇鳥嘌呤或胞嘧啶，減少錯配引發率；(5)引物內或引物之間不能有連續4個堿基的互補；(6)應避免鳥嘌呤三個及三個以上重復。然后，引物特異性的模擬(in silico)驗證(1)通過使用NCBI網站中 Blast-primer工具在所有物種中查找驗證引物的特異性；(2)在UCSC網站中使用 in-Silico PCR工具驗證PCR產物的特異性。分別選取人大腦皮層源癌旁組織和兩種細胞系HEC-I-B(H)、SK-N-SH(S)用這四套引物做RT-PCR，進行轉錄表達模式的檢測。結果表明，四套引物在組織和兩種細胞系中保持強的特異性，并且能夠有效實現區分22個POTHG基因的目的。結果顯示，可通過已獲得的兩種PCDHG基因簇的差異來實現對兩種不同細胞類型的區分。表1、4套PCR引物名稱、序列、長度、退火溫度及其對應的PCR產物片段長度CN 102533969 Aprimer sequence(5， to primer product length(bp) primer name_
3，)length 1R 2R3R4R
hpcdhgalFgcaccccagtctttacttgaag22339 398399580
hpcdhga2Fatcagcgcctcaatctctactc22346405406561
hpcdhga3Ftgaaaggagattccaacctactt23320 379380587
hpcdhgblFggatctgctgtgtgatgatcct22382441442623
hpcdhga4Facaaaaggagaccctaatcttca23318 377378559
hpcdhgb2Fagatctcgtctgtgacaatgcc22382441442623
hpcdhga5Fcaaacaaagaagaacggcga20320 379380561
hpcdhgb3Faatgctgcaccacaagatcttc22390 449450631
hpcdhga6Fgaaaggagaacccaggcaac20319 378379560
hpcdhga7Ftgtaaagaaaacctgccaagtat23321380381562
hpcdhgb4Fctctgtgttaaatccgaatccg22507 566567748
hpcdhga8Faagaatgaagctgatcatggtc22318 377378559
hpcdhgb5Fcgacttcccatcctgagttg20314 373374555
ccaagtttcctatagaagacacc hpcdhga9F24 329 388 389 570
c
hpcdhgb6F ttgacttcacatcctgagactct 23 324 383 384 565
cctttgtctttgttagatgattc
hpcdhgalOF24 351 410 411 592
g
hpcdhgb7Fagatagcatgctactggctagc22 361 420 421 602
hpcdhgallFgagccactcttgatagctgaag22 360 419 420 601
hpcdhgal2Fcttttgctgtcaggtgattcg21 348 407 408 589
hpcdhgc3 Faccatcaggtgtatctcaccac22 455 514 515 696
hpcdhgc4 Fgcttcatgatggtgaagtcacc22 386 445 446 627
hpcdhgc5Fcgctcaagtacatggaggtgac22 488 547 548 729
constantIRgttggtcagtgtggcattgct21
constant2Rgacttcttcttgttgccattgc22
constant3Rcgacttcttcttgttgccattg22
constant4Rctgactgggcacttgtttctg21氺the annealing temperatures of the primer pairs are all 60oCo1、總RNA的獲取，用fTrizol法抽提組織或細胞總RNA組織樣品來源于顱內大腦皮層源癌旁組織；HEC-1-B，SK-N-SH細胞系各2個六孔板的面積。1. 1組織勻漿或細胞裂解；先將100毫克組織剪切成小塊，放入毫升EP管中，力口入1毫升Trizol，用碾磨棒，碾磨勻漿。細胞系則是吸盡培養液，六孔板每孔加0. 5毫升 Trizol，晃動3-5下，再用槍吹打2-3下，確保全部裂解，然后將同一細胞的兩孔中的勻漿液吸入同一 EP管中；1.2RNA分離。室溫放置5分鐘，使樣品充分裂解。每毫升iTrizol加入0. 2ml氯仿，蓋緊蓋子，vortex混勻或猛烈晃動15秒，室溫放置2-3分鐘。12，OOOg 4度離心15分鐘；
1. 3RNA沉淀。吸取含總RNA的上層無色水相至一新的離心管中，每毫升Trizol約可吸取0. 5-0. 55毫升。按每毫升最初的Trizol加入0. 5毫升異丙醇，顛倒數次混勻，室溫沉淀10分鐘。12，OOOg 4度離心10分鐘；1. 4RNA洗滌。在管底可見RNA沉淀，棄上清。每毫升最初的Trizol加入至少1毫升75%乙醇(DEPC水配制)，渦旋或顛倒混勻，7，500g 4度離心5分鐘；1. 5RNA溶解。在管底可見RNA沉淀，棄上清，小心吸盡液體。室溫靜置5_10分鐘， 干燥RNA沉淀。待RNA略干后，加入25微升DEPC水，用槍吹打幾次后，在55到60度溫度下孵育10分鐘，使RNA充分溶解。注意切勿讓RNA過分干燥，否則將極難溶解，且測出的 A260/280值會低于1. 6 ；1. 6測RNA濃度(Eppendorf Biophotometer計)，人大腦皮層源癌旁組織中RNA 濃度 1183. 6 微克 / 毫升，A^0/280 = 1. 67,A260/230 = 2. 00 ；HEC-I-B 細胞系中 RNA 濃度 1787. 8 微克 / 毫升，A^0/280 = 1. 51,A260/230 = 1. 68 ；SK-l-SH 細胞系中 RNA 濃度 502. 8 微克 / 毫升，A260/280 = 1. 51，A260/230 = 1. 67。2、RNA 反轉錄成 cDNARNA模板1. 7微升，10微摩/升Oligo (dT)引物3微升，10微摩/升隨機引物3微升，DEPC水9. 45微升，共17. 15微升，然后75度，孵育5分鐘。加入M-MLV RT 5XBuffer 5微升，IOmM dNTP Mix 1. 25微升，200u/微升M-MLV反轉錄酶1微升，60u/微升rRNasinO RNA酶抑制劑0.6微升，總體積25微升。放置在AB 2720thermal cycler上依次25度，5 分鐘；37度，60分鐘；42度，30分鐘；70度，15分鐘。3、cDNA PCR 擴增反應反應體系為20微升，包含5uM正反向引物各1. 6微升，cDNA模板0. 25微升， 2 XPowerTaq PCR MasterMix 10微升，MiliQ水6. 55微升。PCR循環參數是預變性95度， 2分鐘；變性95度，30秒，退火60度，30秒；延伸72度，1分鐘，循環數40 ；終末延伸72度， 7分鐘。4、結果驗證圖3為人大腦皮層源癌旁組織中22個P⑶HG基因(分別使用各自正向引物和4 個待選反向通用引物)的RT-PCR電泳對比圖及該組織中的PCDHG基因表達簇，圖3中的2， 3,4, 5 分別代表 4 個待選的反向通用引物 constantlR(SEQ ID NO. 23)，constant2R(SEQ IDNO. 24), constant3R(SEQ ID NO. 25), constant4R(SEQ ID NO. 26), al, a2, a3, bl, a4, b2, a5, b3, a6, a7, b4, a8, b5, a9, b6, alO, b7, all, al2, c3, c4, c5 表示 22 種 PCDHG 基因。由圖3可以看出，四個反向引物的產物均具有強的特異性，并且產物條帶清晰單一，且無雜帶，故四個反向引物均能成為22個基因的反向通用引物；同時由圖可知，此22對引物擴增的22個基因能夠通過PCR產物片段大小區分開來。該大腦皮層中特異性表達的基因有 PCDHGA1，PCDHGA2, PCDHGA3, PCDHGB1，PCDHGA4, PCDHGB2, PCDHGA5, PCDHGB3, PCDHGA6, PCDHGA7, PCDHGB4，PCDHGA8, PCDHGB5, PCDHGA9, PCDHGB6, PCDHGA10，PCDHGB7, PCDHGA11， P⑶HGA12，P⑶HGC3，P⑶HGC4，P⑶HGG5，除了 P⑶HGA8表達水平較低外，其他基因都有高水平的表達。圖4為PCDHG基因簇在細胞HEC-I-B(H)和SK-N-SH⑶中的基因表達簇。圖4 中，22個P⑶HG基因在兩個細胞系中差異性表達，并且表達水平亦有明顯差異。在HEC-I-B細胞中特異性表達的基因有 PCDHGB1，PCDHGB5, PCDHGA9, PCDHGB6, PCDHGA10，PCDHGB7, PCDHGA11，PCDHGC3，PCDHGA4，其中僅有 PCDHGB5，PCDHGA9，PCDHGC3 基因檢測有較高水平表達；在SK-N-SH細胞中，除PCDHGA6，PCDHGB4，PCDHGA8基因表達量相對較低外，其余PCDHG 基因均檢測有較高表達。可以看出，二種細胞系的PCDHG基因簇轉錄表達模式有很大不同， 可根據基因簇差異對不同類型的細胞進行識別。 綜上所述，本發明的檢測原鈣粘蛋白基因簇的方法能夠快速檢測原鈣粘蛋白基因簇，能夠實現快速準確檢測人類各個組織或細胞內原鈣粘蛋白Y (PCDHG)基因簇22種 P⑶HG基因中每種基因的表達狀態，并且可對特異性表達的P⑶HG基因的表達水平進行半定量分析，本發明的方法中涉及到的4種引物組能夠用于檢測人類原鈣粘蛋白基因簇的試劑盒的開發，具有非常實用的商業價值。
權利要求
1.一種檢測原鈣粘蛋白基因簇Y的方法，其特征在于，包括如下步驟(a)抽提出組織或細胞內的總RNA，反轉錄獲得cDNA；(b)以cDNA為模板，PCR擴增目的片段；(c)通過檢測PCR擴增產物，得到原鈣粘蛋白基因簇γ的22個基因的表達情況。
2.如權利要求1所述的檢測原鈣粘蛋白基因簇Y的方法，其特征在于，所述PCR擴增采用的引物組選自以下4種引物組中的一組，所述4組引物組具有相同的反向引物，所述正向引物包括22條DNA寡核苷酸，所述22條DNA寡核苷酸的序列分別如SEQ IDNO. I-SEQ ID NO. 22所示；所述4組引物組的反向引物分別如SEQ ID NO. 23-SEQ ID NO. 26所示。
3.如權利要求1或2所述的檢測原鈣粘蛋白基因簇γ的方法，其特征在于，所述PCR 擴增的參數為預變性95°C，2分鐘；變性950C，30秒，退火60°C，30秒；延伸72°C，1分鐘； 終末延伸72°C，7分鐘；共40個循環。
4.一種檢測原鈣粘蛋白基因簇Y的試劑盒，其特征在于，包括以下4種引物組中的一種或多種，所述4組引物組具有相同的正向引物，所述正向引物包括22條DNA寡核苷酸，所述22條DNA寡核苷酸的序列分別如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 22所示；所述4組引物組的反向引物分別如SEQ ID NO. 23-SEQ ID NO.沈所示。
全文摘要
本發明涉及一種生物技術領域的檢測原鈣粘蛋白基因簇γ(PCDHG)的方法及試劑盒，所述方法包括如下步驟(a)抽提出組織或細胞內的總RNA，反轉錄獲得cDNA；(b)以cDNA為模板，PCR擴增目的片段；(c)通過檢測PCR擴增產物，得到原鈣粘蛋白基因簇γ的22個基因的表達情況。本發明的方法能夠有效檢測并區分原鈣粘蛋白基因簇γ的22個基因。所述試劑盒包括4種引物組中的一種或多種。本發明的檢測原鈣粘蛋白基因簇的方法能夠快速檢測原鈣粘蛋白基因簇，能夠實現快速準確檢測人類各個組織或細胞內原鈣粘蛋白γ基因簇22種PCDHG基因中每種基因的表達狀態，并且可對特異性表達的PCDHG基因的表達水平進行半定量分析，本發明的方法中涉及到的4種引物組能夠用于檢測人類原鈣粘蛋白基因簇的試劑盒的開發，具有非常實用的商業價值。
文檔編號C12Q1/68GK102533969SQ20111035915
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月14日 優先權日2011年11月14日
發明者吳強, 湯元霄, 郭亞 申請人:上海交通大學