專利名稱：一種低產尿素的黃酒酵母代謝工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種低產尿素的黃酒酵母代謝工程菌及其構建方法，屬于微生物遺傳工程領域。
背景技術：
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，簡稱EC)，俗稱烏拉坦⑴rethane)，分子式為 NH2COOC2H5(CAS#51-79-6)。動物毒理學試驗顯示，EC對多個物種(包括小鼠、大鼠、倉鼠、 猴)具有致癌作用，能引起動物肺癌、淋巴癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、皮膚癌等惡性腫瘤的發生，表明EC是人類潛在的致癌物質。1974年，EC被世界衛生組織(WHO)下屬的國際癌癥研究機構(IARC)劃為2組B類可致癌物質；2007年3月，IARC進一步提高了 EC的致癌風險等級，將其劃分進2組A類可致癌物質名單。
EC是各種發酵酒精飲料(包括中國黃酒、葡萄酒、日本清酒等)釀造過程中伴隨產生的副產物，不少國家尤其是一些歐美發達國家對市場上各酒種中的EC含量制定了嚴格的限定標準。黃酒是我國特有傳統酒種，當前黃酒中EC含量較高的現狀已成為嚴重制約我國黃酒業發展尤其是國際化發展的瓶頸之一，嚴重阻礙了我國黃酒向國際市場的開拓， 同時在高度重視食品安全的今天，對國內消費者也是一個潛在的威脅。因此，研究出適合我國黃酒企業控制EC含量的策略和方法，降低黃酒中EC含量，使其至少與日本清酒國際標準 (< 100 μ g/L)接軌，對于整個中國黃酒業的發展迫在眉睫，具有重大意義。截至目前，我國尚未針對黃酒、葡萄酒等制定EC限量標準，但國家衛生部近兩年已開始關注此問題，相信標準的出臺只是時間問題。發明內容
本發明的第一個目的是提供一種低產尿素的黃酒酵母代謝工程菌。
本發明提供的低產尿素的黃酒酵母代謝工程菌，是將脲基酰胺酶基因(DUR1，2) 編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子(TPI1 promoter，簡寫為TPIlp)和轉錄終止子(TPI1 terminator，簡寫為TPIlt)控制之下，通過同源重組將TPIlp_DURl， 2-TPIlt基因盒穩定整合入菌株黃酒酵母菌株基因組中得到的黃酒酵母代謝工程菌。
所述脲基酰胺酶基因(DURlJ)的核苷酸序列的GenBank號為NM_001178556。
釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子、轉錄終止子TPIlp來源于大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒p^(212 (Invitrogen)。
所述出發菌株黃酒酵母也稱為釀酒酵母，購自CICC(中國工業微生物菌種保藏管理中心)，菌株保藏號為CICC30395。
本發明的第二個目的是提供上述低產尿素的黃酒酵母代謝工程菌的構建方法。
本發明提供的構建上述低產尿素的代謝工程菌的方法，是利用代謝工程手段，將脲基酰胺酶基因(DUR1，2)編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子(TPIlp)和轉錄終止子(TPIlt)控制之下，再通過兩端分別連接一段酪氨酸酶相關蛋白1基因(TRPl)同源臂，構建trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl同源重組基因盒，隨后通過同源重組原理將 TPIIp-DURl，2-TPIIt基因序列整合入出發菌株黃酒酵母基因組的TRPl位點，使DUR1，2基因獲得穩定高水平表達。
所述酪氨酸酶相關蛋白1基因核苷酸序列的GenBank號為NM_001180315。
本發明所述代謝工程菌可以使細胞能及時分解由精氨酸酶水解精氨酸產生的過多尿素，強化尿素降解途徑，大大減少酵母細胞的尿素分泌量。小試黃酒發酵試驗表明， 與出發菌株相比，成功構建的低產尿素黃酒酵母代謝工程菌使發酵液中尿素含量下降至 8. 5mg/L (下降了 3. 3倍)，最終使酒液中的EC含量下降至53. 4 μ g/L (下降了 3. 5倍)。 本發明的黃酒酵母代謝工程菌株具有明顯的產尿素水平低的特點，利用其發酵生產的黃酒 EC含量低，且風味基本保持不變。
圖1是提取的出發菌株黃酒酵母基因組總DNA電泳圖(M =Marker ；1，2，3 黃酒酵母基因組總DNA)。
圖 2 是 PCR 擴增 DURl，2 基因電泳圖(M :Marker ;1，2 :DUR1，2 基因)。
圖3是pTO212-DURl，2重組質粒構建過程示意圖。
圖4是pYX212-DURl，2重組質粒雙酶切鑒定電泳圖(M :Marker ;1，2 :EcoR I和 BamH I雙酶切重組質粒)。
圖5 是 YRp7-trpl-TPIlp-DURl，2-TPIlt-trpl 重組質粒構建過程示意圖。
圖6是生長在選擇培養基平板上轉化子的照片。
具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒的構建
采用酵母基因組提取試劑盒提取黃酒酵母基因組總DNA(圖1)。利用因特網上公開的釀酒酵母(S. cerevisiae)標準菌株基因組序列數據庫(http//www. yeastgenome. org/)信息，設計合適的引物和酶切位點(PI :ACTGAGGAATTCATGACAGTTAGTTCCGATACAACTGC TG, EcoR I ；P2 TCAGGAGGATCCTCATGCCAATGTCTCTATGACGGCCACT，BamH I)，以提取的基因組 DNA為模板，PCR擴增獲得DURl，2基因編碼框序列(圖2)，雙酶切基因與大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒P^(212 (Invitrogen)后，通過DNA連接反應構建重組質粒pTO212-DURl，2，使 DURl，2的表達置于釀酒酵母組成型高表達啟動子TPI Ip及終止子TPI It控制下(圖3和4)； 通過在TPIlp&TPIlt頭尾設計引物，以上述重組質粒為模板，即可一步擴增出TPIIp-DURI, 2-TPIlt基因盒序列。
實施例2、trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl 基因盒的構建
設計弓I物(P3 TCAGGACCATGGCATTTAATAGAACAGCATCGT，Nco I ；P4 ACTGAGAAGCTTCTTCTGAATCAAACAAG，Hind III)，從黃酒酵母基因組中克隆獲得長度1104bp 的包含編碼框及部分上下游序列的TRPl基因片段，通過DNA酶切、連接反應亞克隆入載體 YRp7，構建重組質粒YRp7-trpl。設計引物，利用PCR在TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒兩端加入酶切位點EcoR V。同時用EcoR V單酶切YRp7-TRPl和TPIlp-DURl，2-TPIlt，通過DNA連接，最終構建出重組質粒YRp7-(trpl-TPIlp-DURl，2-TPIlt-trpl)(圖幻。通過設計頭尾引物，以重組質粒為模板進行PCR，即可一步擴增出兩端分別帶有562bp*M2bp trpl同源臂的 trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl 基因盒序列。
實施例3、整合有TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒的工程菌株的獲得
采用醋酸鋰轉化法，以線形trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl基因盒片段與環形質粒pUT332 (含phleomycin抗性基因)為外源DNA，將兩者共轉化感受態黃酒酵母，然后以選擇培養基平板(YPD+100 μ g/mL phleomycin)篩選轉化子，菌落PCR鑒定出TPIlp_DURl， 2-TPIlt基因盒成功整合入TRPl基因位點的工程菌株，并通過DNA測序確證整合序列的正確性(圖6)。利用非選擇培養基(YPD)對酵母工程菌株連續傳代培養10代，利用野生型釀酒酵母胞內質粒不穩定易丟失的現象(野生型釀酒酵母連續傳代10代后胞內質粒丟失概率 80%)，篩選鑒定出丟失抗性(即丟失質粒pUT33》的工程菌株，并通過設計抗性基因的擴增引物，進行菌落PCR，最終獲得不含外源物種DNA、整合有TPI Ip-DURl，2-TPI It基因盒的工程菌株。
實施例4、工程菌株與出發菌株的小型發酵試驗比較兩者發酵指標、尿素、EC及風味物質含量
利用大米醪培養液(濃度14° Bx)以工程菌株和出發菌株分別進行小試規模黃酒發酵，常規方法考察兩者綜合發酵性能(包括總失重量、總酸、酒精度、氨基態氮)， 發現兩者綜合發酵性能基本一致(表1)；利用尿素檢測試劑盒檢測兩者發酵液中尿素的含量，發現工程菌株相較出發菌株下降了 3.3倍(表1)；利用固相微萃取和氣質聯用 (SPME-GC-MS)法檢測兩者酒液中EC含量，發現工程菌株相較出發菌株下降了 3. 5倍(表 2)；常規方法考察兩者的基本風味物質含量發現基本一致(表幻，表明構建的工程菌株具有明顯的低產尿素效果，利用其發酵生產的黃酒EC含量低，且風味基本保持不變，具有實際工業應用潛力。
表1利用出發菌株和工程菌株發酵黃酒時各項發酵指標及發酵液中的尿素濃度
權利要求
1.一種低產尿素的黃酒酵母代謝工程菌，是將脲基酰胺酶基因DUR1，2編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子和TPIl轉錄終止子控制之下，通過同源重組將 TPIlp-DURl，2-TPIlt基因盒穩定整合入菌株黃酒酵母菌株基因組中得到的黃酒酵母代謝工程菌。
2.如權利要求1所述代謝工程菌，其特征在于，所述黃酒酵母來源于中國工業微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC 30395。
3.權利要求1所述代謝工程菌的構建方法，其特征在于，將脲基酰胺酶基因DUR1，2編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子和TPIl轉錄終止子控制之下，再通過兩端分別連接一段酪氨酸酶相關蛋白1基因同源臂，構建trpl-TPIlp-DURl，2-TPIlt-trpl同源重組基因盒，隨后采用同源重組方法將TPIIp-DURl，2-TPIIt基因序列整合入出發菌株黃酒酵母基因組的TRPl位點。
4.如權利要求3所述方法，其特征在于，所述黃酒酵母為CICC30395。
5.如權利要求3所述方法，其特征在于，所述脲基酰胺酶基因DURl，2與大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒Ρ^(212連接，構建重組質粒pTO212-DURl，2，使DURl，2的表達置于釀酒酵母組成型高表達啟動子TPIlp及終止子TPIlt控制下。
6.如權利要求3所述方法，其特征在于，所述trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl構建方法為1)從黃酒酵母基因組中克隆獲得長度1104bp的包含編碼框及部分上下游序列的TRPl 基因片段，通過DNA酶切、連接反應亞克隆入載體YRp7，構建重組質粒YRp7-trpl ；2)設計引物，利用PCR在TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒兩端加入酶切位點EcoRV，同時用EcoR V單酶切YRp7-TRPl和TPIIp-DURl，2_TPIlt，通過DNA連接，最終構建出重組質粒 YRp7-trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl ；3)通過設計頭尾引物擴增出兩端分別帶有562bp和M2bptrpl同源臂的 trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl 基因盒序列。
7.如權利要求3所述方法，其特征在于，同源重組方法為采用醋酸鋰轉化法，以線形 trpI-TPI Ip-DURl，2-TPI lt_trpl基因盒片段與含phleomycin抗性基因的環形質粒pUT332 為外源DNA，將兩者共轉化感受態黃酒酵母，然后篩選轉化子。
8.權利要求1所述低產尿素的黃酒酵母代謝工程菌應用于發酵生產黃酒。
全文摘要
本發明公開了一種低產尿素的黃酒酵母代謝工程菌及其構建方法，是將脲基酰胺酶基因DUR1，2編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPI1轉錄啟動子和TPI1轉錄終止子控制之下，通過同源重組將TPI1p-DUR1，2-TPI1t基因盒穩定整合入菌株黃酒酵母菌株基因組中得到的黃酒酵母代謝工程菌；本發明的黃酒酵母代謝工程菌株具有明顯的產尿素水平低的特點，利用其發酵生產的黃酒EC含量低，且風味基本保持不變，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/19GK102533573SQ20111035535
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者周景文, 朱旭亞, 管政兵, 陸健, 陳堅 申請人:江南大學