一種纖維素酶產(chǎn)生菌及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種纖維素酶產(chǎn)生菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種纖維素酶產(chǎn)生菌及其應(yīng)用，所本發(fā)明所涉及的纖維素酶產(chǎn)生菌，其具有較好的纖維素酶和半纖維素酶的產(chǎn)酶能力。
背景技術(shù)：
纖維素是自然界中含量最豐富的碳水化合物，是一類可再生的資源和能源。但是纖維素很難被分解利用，如何將纖維素轉(zhuǎn)化為能直接利用的資源和能源是擺在人們面前的一個難題。纖維素的降解有兩條途徑化學(xué)法和生物法，化學(xué)法的特異性差、純度低、污染環(huán)境，而生物酶法可克服這些缺點，因此，纖維素酶一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就受到了世界各國科學(xué)界的重視。纖維素酶是指能降解纖維素kta-1，4-葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系。纖維素酶的主要組分是內(nèi)切Beta-1， 4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和Beta-葡萄糖苷酶。前兩種酶主要溶解纖維，后一種酶將纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，當(dāng)這三種主要成分活性比例適當(dāng)時，就能完成纖維素的降解。纖維素酶的應(yīng)用現(xiàn)在已經(jīng)擴展到醫(yī)藥、遺傳、紡織、日用化工、造紙、環(huán)境、食品發(fā)酵、飼料、工業(yè)洗滌、石油開采、資源再生、廢水處理、農(nóng)業(yè)、生物能源等各個領(lǐng)域，尤其是在生物能源方面的應(yīng)用，前景十分廣闊。纖維素酶的獲得是通過纖維素酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵來得至IJ，而目前存在的主要問題是纖維素酶的酶活力不高，酶解效率不高。選育優(yōu)良菌種是提高纖維素酶活力的關(guān)鍵。因此纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選具有重要的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益。自然界微生物資源豐富，因而從自然界中獲得高產(chǎn)纖維素酶的菌株是很有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供了一種纖維素酶產(chǎn)生菌。本發(fā)明的纖維素酶產(chǎn)生菌具有較好的纖維素酶和半纖維素酶的產(chǎn)酶能力，尤其是對Beta-葡萄糖苷酶具有良好的生產(chǎn)能力。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種纖維素酶產(chǎn)生菌，纖維素酶產(chǎn)生菌的分類命名為檜狀青霉(Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NOl所述，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期:2011年10月9日，保藏號CGMCC5314。優(yōu)選的是，所述的纖維素酶產(chǎn)生菌的應(yīng)用中，所述纖維素酶產(chǎn)生菌應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶。本發(fā)明所述的纖維素酶產(chǎn)生菌具有較好的纖維素酶和半纖維素酶的產(chǎn)酶能力，尤其是對Beta-葡萄糖苷酶具有良好的生產(chǎn)能力。本發(fā)明的纖維素酶產(chǎn)生菌以及所生產(chǎn)的纖維素酶和半纖維素酶在生物燃料、醫(yī)藥、日用化工、食品發(fā)酵等多個行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前
景ο


圖1為本發(fā)明所述的纖維素酶產(chǎn)生菌的基因序列的進化樹。圖2為本發(fā)明所述的纖維素酶產(chǎn)生菌的菌株掃描電鏡照片。圖3為本發(fā)明的檜狀青霉9_3(在微晶纖維素上生長)的產(chǎn)酶曲線。圖4(a)為分別以三種纖維素生物質(zhì)為底物，里氏木霉的粗酶液單獨水解、檜狀青霉9-3的粗酶液單獨水解以及里氏木霉的粗酶液和檜狀青霉9-3的粗酶液共同水解過程中的還原糖濃度變化情況圖。圖4(b)為分別以三種纖維素生物質(zhì)為底物，里氏木霉的粗酶液單獨水解、檜狀青霉9-3的粗酶液單獨水解以及里氏木霉的粗酶液和檜狀青霉9-3的粗酶液共同水解過程中的葡萄糖濃度變化情況圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。本發(fā)明提供一種纖維素酶產(chǎn)生菌，纖維素酶產(chǎn)生菌的分類命名為檜狀青霉 (Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NOl所述，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2011年10月9日，保藏號CGMCC5314。所述的纖維素酶產(chǎn)生菌的應(yīng)用中，所述纖維素酶產(chǎn)生菌應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶。一、纖維素酶產(chǎn)生菌的制備方法(1)將采集的可能含有菌種的樣品取適量添加到含有纖維素的富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-7天后測定纖維素酶的活性，從而確定含有可以產(chǎn)生纖維素酶的菌群的樣品；(2)針對上述步驟(1)所確定的含有可以產(chǎn)生纖維素酶的菌群的樣品，再篩選該樣品中能夠產(chǎn)生高活力的纖維素酶的菌株，即將該樣品的富集培養(yǎng)液稀釋涂布在土豆汁固體平板上，挑取平板上長出的各個菌落到產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-7天后測定纖維素酶活，從中篩選出生產(chǎn)纖維素酶酶活力較高的菌株。二、纖維素酶產(chǎn)生菌的鑒定1、纖維素酶產(chǎn)生菌的基因序列的鑒定(1)利用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，收集菌絲，提取真菌的基因組。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10g/l，玉米漿10 40g/l，(MM)2SO4 2 6g/l，甘油1 3g/ 1，KH2PO4 2 8g/l，MgS04 0 4g/l，CaC03 0 5g/l，Tween80 0 4g/l，pH4 7，121°C， 滅菌20min。(2)利用真菌18S rDNA的通用引物，以真菌基因組為模板，通過PCR擴增反應(yīng)，擴增真菌的18S rDNA基因，并對PCR產(chǎn)物進行純化，送去測序，對該菌18S rDNA 的測序結(jié)果進行數(shù)據(jù)庫同源性比較。其中，真菌18S rDNA的通用上游引物序列為 GGAAGGGRTGTATTTATTAG ；通用下游引物序列為TCCTCTAAATGACCAAGTTTG?；谠摼甑?8S rDNA序列已登錄GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為⑶477623，基于該菌株的18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，使用MEGA 4. 0軟件，制作進化樹(見圖1)。分析結(jié)果顯示該菌株與Penicillium piceum代表菌種的親緣關(guān)系最近，最終命名為檜狀青霉9-3。被比對分析序列右側(cè)為GenBank中的序列號。2、纖維素酶產(chǎn)生菌的菌株形態(tài)特征的表征圖2為本發(fā)明的纖維素酶產(chǎn)生菌的掃描電鏡照片。分生孢子梗發(fā)生于氣生菌絲， 孢梗莖短，帚狀枝雙輪生，彼此緊貼。?；枯?-10個，瓶梗每輪5-8個，披披針狀。分生孢子橢圓形或近球形，壁光滑。右圖為菌落在PDA平板上30°C生長7天，菌落邊緣的菌絲體薄，質(zhì)地絮狀，邊緣兼絨狀。分生孢子面暗黃綠色，菌落表面有少量淡黃色滲出液，反面黃褐色。三、纖維素酶產(chǎn)生菌的應(yīng)用接種該菌到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中J8°C，190rpm培養(yǎng)，在一定時間點取樣，離心，取上清測定胞外蛋白濃度和各個纖維素酶和半纖維素酶活力。以下實驗中，測定濾紙酶酶活、內(nèi)切葡聚糖酶酶活、Beta-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活。其中，內(nèi)切葡聚糖酶和 Beta-葡萄糖苷酶屬于纖維素酶，且通過濾紙酶活可以確定纖維素酶的存在，并且通過濾紙酶活力可以表征纖維素酶的活力水平；木聚糖酶屬于半纖維素酶，通過木聚糖酶測定可以確定半纖維素酶的活力水平。發(fā)酵培養(yǎng)基微晶纖維素20 50g/l，玉米漿10 40g/l，(MM)2SO4 2 6g/l， 甘油 1 3g/l, KH2PO4 2 8g/l, MgSO4 0 4g/l, CaCO3 0 5g/l, Tween80 0 4g/l, pH4 7，121°C 滅菌 20min。1、纖維素酶活測定方法(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配置10mg/ml葡萄糖母液，并稀釋成2. 0，3. 3，5. O和6. 7mg/ml的葡萄糖溶液樣品。取0. 5ml的葡萄糖溶液樣品加到Iml的0. 05M, ρΗ4· 8的檸檬酸緩沖溶液中，再加3ml 的DNS反應(yīng)液，混勻，沸水浴加熱5min，冷卻至室溫。使用分光光度計測定0M40。以0M40 為縱坐標(biāo)，對應(yīng)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制O. OlM( = 0. 15g/100ml 緩沖液)，稀釋成 10,5,3. 33 禾口 2ymol/ml 的木糖溶液樣品，取0. 2ml加到1. 8ml的木聚糖底物溶液中，添加;3mlDNS反應(yīng)液，混勻，沸水浴加熱 5min，冷卻并離心。使用分光光度計于波長MOnm下測定上清液吸光度0M40。以0D540為縱坐標(biāo)，對應(yīng)木糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)BSA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用Bradford法測定蛋白濃度，制作BSA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即分別吸取10mg/ml 的BSA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液0、10、15、20、25、30μ 1，分別加水定容至lOOul，加入Iml Bradford 試劑，混勻，室溫靜置lOmin。以不含蛋白質(zhì)的混合液為空白對照。使用分光光度計測定 0D595。測定三次求平均值。以0D595為縱坐標(biāo)，對應(yīng)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)濾紙酶酶活測定試管內(nèi)添加1. 0ml,0. 05M，pH4. 8檸檬酸鈉緩沖液。添加0. 5ml的稀釋酶液。加熱至50°C，添加一條濾紙條帶混合。50°C水浴反應(yīng)60min，立即添加3. OmlDNS反應(yīng)液混勻終止反應(yīng)。沸水浴加熱5min后，轉(zhuǎn)移至冷水浴，冷卻。取0.45ml顏色反應(yīng)后的混合液，加入2. Oml去離子水或蒸餾水，充分混勻。在MOnm下讀取吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣品的葡萄
糖含量。(5)內(nèi)切葡聚糖酶酶活測定添加0. 5ml的稀釋酶液至試管內(nèi)。加熱至50°C，添加0. 5ml的底物溶液(用0. 05M, PH4. 8的檸檬酸緩沖液溶解，制備2%羧甲基纖維素(鈉)，取代度=0. 7)，50°C水浴反應(yīng) 30min。添加3. Oml的DNS反應(yīng)液，混勻。沸水浴加熱5min。轉(zhuǎn)移樣品至冷水浴，添加20ml 蒸餾水或去離子水，充分混勻。540nm處讀取樣品的吸光度。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測定管的樣品的吸光度轉(zhuǎn)換為葡萄糖的濃度。(6) Beta-葡萄糖苷酶酶活測定添加Iml酶液溶解于檸檬酸緩沖液中。加熱至50 °C，添加1.0ml的底物溶液 (15. OmM纖維二糖，溶解于0. 05M, pH4. 8的檸檬酸緩沖液，該反應(yīng)液需要現(xiàn)用現(xiàn)配)，混勻。 50°C水浴反應(yīng)30min。沸水浴加熱5. Omin，終止反應(yīng)。冷卻，通過葡萄糖分析儀測定葡萄糖
的含量。(7)木聚糖酶酶活測定添加1. 8ml的底物溶液(用0. 05M，pH5. 3的檸檬酸緩沖液溶解，制備1 %木聚糖懸浮液)和添加0. 2ml的稀釋酶液至試管內(nèi)。50°C水浴反應(yīng)5min。添加3. Oml的DNS反應(yīng)液，混勻。沸水浴加熱5min。轉(zhuǎn)移樣品至冷水浴，然后離心沉淀未反應(yīng)的底物，上清液于 540nm處讀取樣品的吸光度。根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測定管的樣品的吸光度轉(zhuǎn)換為木糖的濃度。(8)蛋白質(zhì)濃度測定使用Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度，即將蛋白質(zhì)樣品進行適當(dāng)倍數(shù)的稀釋，取 100 μ 1加入Iml Bradford試劑，混勻，靜置lOmin，后使用分光光度計測定0D595。三次測定求平均值。后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計算出該樣品的蛋白質(zhì)濃度。2、纖維素酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶的特性分析1、產(chǎn)酶曲線本發(fā)明的纖維素酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)時間為8天，每隔24h取樣。分別測定不同培養(yǎng)時間下的濾紙酶酶活、Beta-葡萄糖苷酶酶活和蛋白濃度，繪制發(fā)酵過程曲線。圖3為本發(fā)明的檜狀青霉9-3(在微晶纖維素上生長)的產(chǎn)酶曲線(其中， 代表濾紙酶酶活，▲代表蛋白濃度，■代表Beta-葡萄糖苷酶酶活)。在下，檜狀青霉培養(yǎng) 3天時，此時已經(jīng)具有較高的濾紙酶酶活(1. 47IU/ml)、Beta-葡萄糖苷酶酶活(12. 03IU/ ml)、蛋白濃度(1. 16mg/ml)。證明該菌的產(chǎn)酶周期較短，容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。并且，由圖 3可以看出，檜狀青霉培養(yǎng)7天可達到最高產(chǎn)酶。2、纖維素酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶能力的比較將黑曲霉CGMCC 3. 316(購自于中國普通微生物菌種保藏中心)，里氏木霉RUT C-30 (CICC13052,購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)和檜狀青霉9_3接種于微晶纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25 30°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 250轉(zhuǎn)/分進行震蕩培養(yǎng)，取發(fā)酵 5天時培養(yǎng)液，分別測定濾紙酶活、β -葡萄糖苷酶酶活、內(nèi)切葡聚糖酶酶活、木聚糖酶活力以及蛋白濃度。表1檜狀青霉9-3與黑曲霉CGMCC 3. 316和里氏木霉RUT C-30的產(chǎn)酶能力比較
權(quán)利要求
1.一種纖維素酶產(chǎn)生菌，其特征在于，纖維素酶產(chǎn)生菌的分類命名為檜狀青霉 (Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NOl所述，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2011年10月9日，保藏號CGMCC5314。
2.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶產(chǎn)生菌的應(yīng)用，其特征在于，所述纖維素酶產(chǎn)生菌應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種纖維素酶產(chǎn)生菌，纖維素酶產(chǎn)生菌的分類命名為檜狀青霉(Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NO1所述，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2011年10月9日，保藏號CGMCC5314。本發(fā)明所述的纖維素酶產(chǎn)生菌具有較好的纖維素酶和半纖維素酶的產(chǎn)酶能力，尤其是對Beta-葡萄糖苷酶具有良好的生產(chǎn)能力。本發(fā)明的纖維素酶產(chǎn)生菌以及所生產(chǎn)的纖維素酶和半纖維素酶在生物燃料、醫(yī)藥、日用化工、食品發(fā)酵等多個行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/80GK102533563SQ20111035166
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者武改紅, 蔡鵬麗, 賈文娣, 陳樹林, 馬延和 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所, 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所