專利名稱：檢測病原的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測病原的方法、試劑盒及其引物，尤其涉及一種同時在一個反應液中檢測多種病原的方法、試劑盒及其引物對組合。
背景技術：
種苗為農業生產的根本，其優劣與作物生產有密切的關系，栽植優良的種苗，縱然不需改變栽培技術也能提高產值，因此各發達國家皆將健康種苗管理制度列為重要的防疫措施。臺灣農委會于1997年召開會議選定13種作物為健康種苗推動對象，其中即包含了甘蔗與文心蘭。臺灣甘蔗種植面積有1萬1千余公頃，制糖與生食甘蔗年產值各約7億元。近年來甘蔗除制糖與生食用途外亦被開發作為生物質能源作物，因此在臺灣有限的土地上，如何有效種植獲得更高產量甘蔗更不容忽視。甘蔗的生長期長達一年以上，栽培過程若遭受病害侵襲將影響甘蔗發育且會降低糖產率，而危害甘蔗的病原有很多種，最常見且危害較嚴重的有 Ustilago scitaminea、Peronosclerospora sacchar1、Leifsona xyli subsp、Xanthomonas albilineans等,分別會導致黑穗病、露菌病、宿根矮化病與白條病發生。上述四種病原可感染不只一種宿主，已報道會感染黑穗病的作物有甘蔗、玉米、鼠尾草與小麥等；已報道會感染露菌病的作物有玉米、蔬菜(花椰菜、芹菜與甘藍等)與水果花卉(香洋瓜、葡萄與玫瑰等)。以上病原造成的病害，會導致植物生長遲緩且降低產量5%以上，造成收成上極大的損失。由于傳統判斷病害方法所需的時間較長，且需由專業者判斷，利用分子生物檢測技術檢測作物病害，已開始廣被接受且重視。因此，發明人經悉心試驗與研究，并本著鍥而不舍的精神，構思出本發明“檢測病原的方法及試劑盒”，以下為本發明的說明。
發明內容
本發明針對4種常見的病原Ustilago scitaminea、PeronosclerosporasaccharicLeifsona xyli subsp>Xanthomonas albilineans 開發快速且靈敏的檢測技術，以協助判斷病害并輔助健康種苗制度的建立。本發明中依病原的特定基因序列設計專一性引物，成功地建立可以在一個反應液中同時檢測多組病原的多重聚合酶鏈式反應(multiplex PCR)與高靈敏性的實時定量聚合酶鏈式反應(real-timePCR)技術。針對多重PCR檢測，當調整PCR條件至400 2000nM(優選為800nM以上)的dNTP濃度，及3mM 7mM(優選為4mM以上)的Mg2+濃度時，可在一個反應液中同時檢測任意目標病原，檢測極限為1，000個拷貝。以實時PCR來檢測上述病原其擴增效率可達90% 110% (退火溫度30 62°C)，檢測極限為10個拷貝。除了上述兩種PCR，也可使用生物芯片來快速篩檢，其是利用本發明設計的專一性引物夾出的基因片段，取其中約25個連續核苷酸作為探針以達到專一性檢測之目的。
本發明的主要目的在于提供一種檢測病原的方法，包括:提供核酸樣本；以及利用至少一組選自 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4、SEQID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8,SEQ IDN0.9和SEQ ID N0.10的引物對的序列、其互補序列、其衍生序列或其簡并序列來檢測該核酸樣本中是否存在病原。本發明的另一方面在于提供一種用于檢測病原存在與否的試劑盒，包括:至少一組選自 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.7 和 SEQ IDN0.8,SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10的引物對的序列、其互補序列、其衍生序列或其簡并序列。本發明的又一方面在于提供一種檢測病原的方法，該病原是選自UstiIagoscitaminea、Peronosclerospora sacchar1、Leifsona xylisubsp 和 Xanthomonasalbilineans，該方法包括:(a)提供具有核酸探針的芯片，其中利用至少一組選自SEQ IDN0.3 和 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8、SEQIDN0.9和SEQ ID N0.10的引物序列、其互補序列、其衍生序列或其簡并序列所擴增的核酸片段中的20-30個連續的核苷酸相同或互補的核苷酸作為該核酸探針；(b)提供待測樣本；
(c)使該待測樣本與芯片上的核酸探針進行雜交反應；以及(d)鑒定步驟(C)的雜交反應結果。本發明的功效與目的，可通過下列實施方式說明，以便更深入地了解。
圖1:同一條件下以實時PCR擴增的退火曲線。圖2:實時PCR反應的標準曲線圖。圖3(A) (E):5組 引物單獨PCR檢測極限試驗，其中圖3(A)為2.5S基因；圖3⑶為UbE基因；圖3 (C)為Lxx基因；圖3 (D)為Xa基因；圖3 (E)為PS252基因。圖4(A) (C):PS252-FR引物總量與Mg2+濃度對PCR反應的影響結果，其中圖4(A)為引物總和200nM的反應；圖4(B)為引物總和400nM的反應；圖4(C)為引物總和800nM的反應。圖5:不同基因組合在不同Mg2+濃度下的多重PCR結果，其中圖5(A)為2組基因組合反應；圖5(B)為3組基因組合反應；圖5(C)為4組基因組合反應。圖6(A) ⑶:5組引物多重PCR分析結果，其中圖6(A)為調整參數前5組引物多重PCR分析結果；圖6(B)為調整參數后5組引物多重PCR分析結果。圖7:5組引物的多重PCR濃度差異極限分析。圖8:例示樣品的多重PCR分析結果。
具體實施例方式(一)引物設計本發明的實施例中共使用5組引物，分別為針對甘蔗基因與四種病原Ustilagoscitaminea、Peronosclerospora sacchar1、Leifsona xyli subsp、Xanthomonasalbilineans的基因設計的專一性引物，如表I所不。Ustilago scitaminea以bE mating基因進行比對(Accession N0.EF185086、EF185087、U61290、U61291)，設計 UbE-FR 特異性引物對，可擴增215堿基對產物。Leifsona xyli subsp以ITS序列進行比對(AcessionN0.AF 034641、AF056603、EU723209、DQ232616、DQ232615、AF034642)設計 Lxx-FR 特異性引物對，可擴增 145 堿基對產物。Xanthomonas albilineans 以 ITS(AY940633、AF209751、AF251154、AF251156、AY940629、GQ461740、⑶223221)進行比對，設計的特異性引物對為Xa-FR,可擴增116喊基對產物。Peronosclerospora sacchari發表的序列少，以COX基因序列進行比對(Acession N0.DU116052、EU116053、EU116054、AY286225、EU116058、DQ365724、EF406089)，設計PS252-FR引物對，可擴增252堿基對產物。在內部對照組方面，本發明實施例是選用甘蔗的2.5S基因進行設計，由Acession N0.BQ536525設計2.5S-FR引物對，可擴增171堿基對產物。但是本領域技術人員可以了解的是，對照組的引物對會依據樣本來源而異，而樣本來源可以是會被上述病源感染的任何植物及環境。因此，對照組的引物對不限于本發明實施例所使用的2.5S-FR引物對，本領域技術人員可以依據樣本來源選擇適當的對照組引物對。另外，本發明所使用的引物對也不限于表I所揭露之序列，只要表I的序列經些許修飾或變化后仍能用于擴增其各自的目標片段，則該些經修飾或變化的序列都在本發明的保護范圍內。上述經修飾或變化的序列可為表I序列的互補序列、衍生序列或簡并序列。其中衍生序列是指于SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.10或其互補序列的3'端或5'端進行修飾，使其仍與原序列具有70%以上同源性的核苷酸序列，優選為與原序列具有90%以上同源性的核苷酸序列，若僅在5'端進行修飾，則衍生序列是指與原序列具有50%以上同源性的核苷酸序列；簡并序列是指SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.10或其互補序列中30%以下的核苷酸被其他核苷酸所取代，優選為10%以下的核苷酸被其他核苷酸所取代。本發明所屬技術領域中普通技術人員知道，傳統PCR反應中，使用的引物欲得到較佳擴增效果，除了引物本身的結合位置、長度及GC含量比例外，還須調整反應時的引物濃度、離子濃度、反應溫度或時間，以使欲擴增的片段被有效且專一的放大。倘若引物對數量以及所要擴增的片段數增加，引物與引物之間的相互作用增加，合適的反應條件也越趨嚴苛，因此在同一 PCR反應中使用多組引物，且能達到專一性的放大效果，并非相同研究領域輕易可完成的。此外，本發明所屬技術領域中普通技術人員還知道，傳統PCR檢測使用的引物只能適用于單一的檢測方式，并不適用于多種檢測方式，針對不同類型的PCR設計的引物/引物對，其適用范圍也有所不同。實時PCR檢測得出的擴增產物(amplicon)彼此間的大小差異必須相同或接近，一般的作法，是將基因片段大小的差異縮小在50bp以內，以獲得較佳的檢測結果。反之，多樣單步驟PCR檢測得出的擴增產物彼此間的大小差異必須明顯，如此在進行后續電泳分析時才能于同一凝膠上區分。本發明所開發的引物對組合，具有避免形成二聚物、較佳的GC含量比例、基因大小可于同一凝膠上區分，以及PCR退火溫度需相近等特性，克服了傳統PCR檢測使用的引物只能適用于單一檢測方式，可分別適用于實時PCR與多重PCR，可于同一條件、同一反應液中，同時進行專一性PCR擴增反應。表I
權利要求
1.一種檢測病原的方法，包括: 提供核酸樣本；以及利用 至少一組選自 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4, SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6, SEQ IDN0.7和SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10的引物、其互補序列、其衍生序列或其簡并序列來檢測該核酸樣本中是否存在病原。
2.按權利要求1的方法，其中該病原包括Ustilagoscitaminea、Peronosclerosporasacchar1、Leifsona xyli subsp 以及 Xanthomonas albilineans 中的至少一項。
3.按權利要求1的方法,其中該核酸樣本是來自植物或環境樣本,且該環境樣本包括土壤及水的至少其中之一。
4.按權利要求1的法，還包含: 使用對照組的引物對，其中該對照組引物對為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2、其互補序列、其衍生序列或其簡并序列。
5.按權利要求4的方法，其中該衍生序列是指于SEQID N0.1至SEQ ID N0.10或其互補序列的3'端或5'端進行修飾，使其仍與原序列具有70%以上同源性的核苷酸序列；以及該簡并序列是指SEQ IDN0.1至SEQ ID N0.10或其互補序列中30%以下的核苷酸被其他核苷酸所取代。
6.按權利要求4的方法，其中該衍生序列是指于SEQID N0.1至SEQ ID N0.10或其互補序列的3'端或5'端進行修飾，使其仍與原序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；以及該簡并序列是指SEQ IDN0.1至SEQ ID N0.10或其互補序列中10%以下的核苷酸被其他核苷酸所取代。
7.按權利要求4的方法，其中該核酸樣本是來自植物，且該對照組引物對與該植物的基因序列互補，其中該植物包括甘蔗、煙草、鼠尾草、小麥、玉米、花椰菜、香洋瓜、葡萄、柑橘、西紅柿、番椒、玫瑰及葉菜類的至少其中之一。
8.按權利要求2的方法，其中所述檢測包括 執行多重聚合酶鏈式反應與實時定量聚合酶鏈式反應其中之一。
9.按權利要求8的方法，還包括將每一引物對的極限值調整至相同。
10.按權利要求8的方法，其中: 當執行多重聚合酶鏈鎖反應時，使用介于400 2000nM的dNTP濃度，及介于3 7mM的Mg2+濃度；及 當執行實時定量聚合酶鏈鎖反應時，使用介于30 62°C的退火溫度(annealingtemperature)。
11.一種用于檢測病原存在與否的試劑盒，包括:至少一組選自 SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9和SEQID N0.10的引物序列、其互補序列、其衍生序列或其簡并序列。
12.一種檢測病原的方法，該病原選自 Ustilago scitaminea、Peronosclerosporasacchar1、Leifsona xyli subsp 和 Xanthomonasalbilineans,該方法包括: (b)提供具有核酸探針的芯片，其中是利用至少一組選自SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10的弓I物序列、其互補序列、其衍生序列或其簡并序列所擴增的核酸片段中的20-30個連續的核苷酸相同或互補的核苷酸作為該核酸探針； (b)提供待測樣本； (c)使該待測樣本與芯片上的核酸探針進行雜交反應；以及 (d)鑒定步驟(C)的雜交反應結果。
13.按權利要求12的方法，其中該步驟(a)還包含:使用對照組的引物對所擴增的核酸片段中的20-30個連續的核苷酸相同或互補的核苷酸作為對照組核酸探針。
14.按權利要求13的方法，其中該對照組引物對為SEQID N0.1和SEQ ID N0.2、其互補序列、其衍生序列或其簡并序列，并且該宿主為甘蔗。
15.按權利要求12的方法， 其中步驟(c)之前還包含: 擴增該待測樣本；以及 使用標記分子標記該待測樣本擴增后的產物。
全文摘要
本發明提供了一種檢測病原的方法。該方法包括提供核酸樣本；以及利用至少一組選自SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物序列、其互補序列、其衍生序列或其簡并序列來檢測該核酸樣本是否存在病原。
文檔編號C12Q1/04GK103088115SQ20111035108
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者黃怡仁, 陳郁璇, 蕭耀基, 胡金勝, 陳立祥 申請人:臺灣糖業股份有限公司