專利名稱：渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉的篩選及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于海洋生物資源及微生物菌種，具體體現在一種分離自渤海灣水域的殺線蟲枝頂孢霉菌株UcreMWi^B cephalosporium) BH-0531及其篩選和應用。
背景技術：
線蟲作為一類重要的病原物，它的危害已成為農林生產上的重要問題。全世界已報道的植物寄生線蟲達200多屬5000余種。植物寄生線蟲病害給全世界農業每年帶來近1250億美元的經濟損失，僅次于真菌病害。因此，治理土壤及植物寄生線蟲已成為一個全球性的、迫切學要解決的重要問題。化學殺線劑，如40年代早期出現的溴甲烷，50年代后期出現氨基甲酸酯類和有機磷酸酯類等，多為有毒農藥，被發現有致畸、致癌等劇毒作用，同時存在嚴重的3R問題抗藥性、藥物殘留、害蟲再猖撅。隨著人類環保意識的增強，生物防治已成為線蟲防治的主導。微生物是一類種類繁多的可再生資源，是最豐富的遺傳基因庫，也是植物病原線蟲的重要天敵，以及次級代謝產物是生物活性物質的重要來源。目前開發的第一代線蟲生防制劑主要是活菌體制劑，其中研究最多的生防因子包括捕食線蟲真菌、內寄生真菌和寄生性細菌。但活菌體制劑由于土壤生態系統中的微生物區系之間存在著不同程度的相互抑制作用，導致活體生防菌在不同國家的不同類型土壤中防治效果的不穩定性和不一致性，使得其使用受到很大限制。真菌的次生代謝產物作為第二代線蟲生防因子，以直接作用于農作物線蟲的方式發揮作用，有著作用快、藥效高、環境相容性好、不容易造成二次污染等優點。已發現的殺線蟲活性代謝物進行統計有179種之多，包括生物堿類，多肽類，萜類，大環內酯類，氧雜環類，苯并類，醌類，脂肪類，簡單芳香類等。但多停留于實驗室研究階段，且大多為水溶性較差的脂溶性物質，需要通過添加增效劑來助溶，這為實際應用造成了困難。因此，開發出高效、低毒、相對專一性以及廉價的微生物殺線劑，將會是今后的研究重點。海洋占地球總面積71%，地球生物80%生活在海洋。海洋特殊的環境空間造就了海洋生物獨特的次級代謝循環，演化出了不同于陸生生物的遺傳背景和代謝途徑，是尋找新藥或先導化合物的寶貴資源。c印halosporin C是最早從海洋真菌中分離到的抗生素，此后有關這方面的研究成指數增長，如澳大利亞Capon研究組從南澳大利亞海洋篩選出兩株殺線蟲海洋真菌Asper^iVAz1S caneus 和 Raspailia sp (Caponn RJ，2003)。肖永堂等(2005)對188株海洋真菌代謝物進行殺線蟲毒力測定，毒力級別達到A級的菌株占1. 60% ；而死亡率達50%以上的菌株占總數的43. 1%。鄭忠輝等(2005)對一株海洋真菌代謝物對小桿線蟲作用現象進行觀察，認為是一種神經毒劑。展示了海洋真菌在殺線蟲領域的潛能。
發明內容
本發明的一個目的在于克服現有殺線蟲劑中存在的不足和殺線蟲劑高效生產菌種資源匱乏的問題，從而提供一株具有殺線蟲功用的渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株BH-0531菌株(保藏號CGMCC-5445)。本發明的另一個目的在于提供一種渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株的篩選方法。本發明的還一個目的在于提供一種渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株BH-0531菌株在制備作為生物活性物質用于農用殺蟲劑、生物農藥和抗生素發酵生產中的應用。為實現上述目的，本發明提供了如下的技術方案
一種渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株(.Acremonium cephalosporium )BH-0531菌株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC-5445。保藏時間2011-11_4。該菌種是由采自渤海的(經度E 117° 53' 23.2"，緯度N 38° 55' 51.0〃)底層海水樣本中分離。菌落特征在查氏瓊脂上7d直徑33-35mm，14d達50-65 mm ；初始質地絨氈狀；初生菌絲體白色，隨培養時間延長呈淺黃至淺粉紅色，由于大量孢子產生菌落質地成粉質狀，菌落邊緣近整齊；無滲出液；菌落反面呈淺橘或黃色。菌絲特征有隔，較細，直徑(2.0士 μ m)；分生孢子梗從菌絲生出，直立，短小，末端漸細，頂端球形，生分生孢子無隔、多為橢圓形，長軸直徑3. 0 4. 0 μ m，短軸直徑2. 1士 μ m，壁近于光滑。枝頂孢霉BH-0531菌株隸屬于枝頂孢霉屬Ucremonium ；舊稱頭孢霉屬，Cephalosporium.)。該菌株具有在海水培養基和不含海水的查氏、PDA等培養基上生長，并產生殺線蟲等活性物質的性能，所產生的活性物質殺線蟲活性高，還可抑制真菌和細菌的生長。因此可應用于殺線蟲生防制劑、生物農藥和抗生素等發酵生產領域。本發明所述的篩選指的是以線蟲的死亡率為指標對菌株的殺線蟲能力進行評價。本發明進一步公開了渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株BH-0531的篩選方法，其特征在于
(1)菌種的分離、純化
樣本來自渤海灣的底層海水，經孔徑0.45 μ m硝酸纖維素濾膜(f50)過濾后，將濾膜置于海水固體培養基上，于沈！恒溫培養獲得菌落，采用挑單孢法，將其轉入新的平板培養，此過程反復進行，直至菌落純化為止；所述的海水固體培養基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏 2g/L，海水 600mL/L，蒸餾水 400mL/L，瓊脂 20 g/L ；
(2)菌種的篩選
1)將上述分離純化的菌種接種于液體培養基中進行搖瓶發酵培養，發酵培養后的培養液經孔徑為0. 22Mffl濾膜過濾，收集得到發酵濾液；其中所述的液體培養基是指查氏液體培養基=NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, KCl 0. 5 g/L, MgSO4 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L，蔗糖 30g/L, PH 自然；
或海水液體培養基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，海水600mL/L，蒸餾水400mL/L ；
培養條件為接種量2 X IO6的孢子懸液，轉速120r/min，初始pH6. 5J6°C發酵96h ；
2)使用M孔細胞培養板，在每孔中加入ImL發酵濾液和100μ L線蟲懸液(平均1500頭線蟲/100 μ L)，^TC靜置3d，5d后，解剖鏡下統計線蟲死亡率；分離篩選后獲得具有殺線蟲功用的來自渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株BH-0531，其毒力級別達到死亡率彡90%的A級；
(3)菌種培養條件的優化
優化的培養基為去皮馬鈴薯150g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，海水含量600ml/L ； 其中去皮馬鈴薯150g/L指的是去皮馬鈴薯150g置400mL蒸餾水中煮汁，取汁液，再定容至 400mL ；
優化的培養條件為接種量2X IO6的孢子懸液，轉速120r/min，初始pH6. 5J6°C發酵 96h ；培養得到殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株。本發明所述及的篩選是指利用線蟲死亡率作為指標，通過對菌株的殺線蟲能力進行評價，以線蟲死亡率高(死亡率> 90%)為標準實施篩選，所述線蟲為松材線蟲(由中國農科學院植保所提供)。本發明從渤海水域分離得到并證實具有殺線活性的BH-0531菌株就是在這種背景下利用線蟲死亡率作為指標，通過實驗對發酵影響較大的PH值、接種量、培養溫度、 培養時間等培養條件和碳氮源及其含量進行優化而獲得的。其殺線活性達到A級90%)，可用不含海水的培養基培養，適用于常規發酵設備。該菌產生的殺線蟲物質為中性、水溶性、耐熱活性物質，分子量<6000 D0該物質還被證實具有抑制酵母菌和細菌的抑菌作用。菌株經經典分類指標的觀察鑒定及ITS序列分析確定為 Acremonium cephalosporium. BH-0531。本發明進一步公開了渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株BH-0531菌株在制備作為生物活性物質用于農用殺蟲劑、生物農藥和抗生素發酵生產中的應用。其中所述的農用殺蟲劑、生物農藥和抗生素對象為植物病原線蟲、植物病原真菌和植物病原細菌。本發明更加詳細的說明如下 一、具體技術支撐
㈠微生物名稱和保藏情況
枝頂孢霉BH-0531菌株。該菌種在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC-5445，保藏時間2011_11_4。㈡菌株的生物學特性及鑒定
1.枝頂孢霉BH-0531菌株的形態學特征
菌落特征在查氏瓊脂上7d直徑33-35mm，14d達50-65 mm ；初始質地絨氈狀；初生菌絲體白色，隨培養時間延長呈淺黃至淺粉紅色，由于大量孢子產生菌落質地成粉質狀， 菌落邊緣近整齊；無滲出液；菌落反面呈淺橘或黃色。菌絲特征有隔，較細，直徑(2.0士 μ m)；分生孢子梗從菌絲生出，直立，短小， 末端漸細，頂端球形，生分生孢子無隔、多為橢圓形，長軸直徑3. 0 4. 0 μ m，短軸直徑 2. 1士 μ m，壁近于光滑。依據《菌物學大全》(裘維蕃，菌物學大全[M].北京科學出版社，1998:890) 和《常見與常用真菌》(中國科學院微生物研究所[M].北京科學出版社，1973)，該菌特征與枝頂孢霉特征相符，極似《常見與常用真菌》中所描述的頂頭孢霉 acremonium.)。2. 18S rDNA ITS序列分析及鑒定結果測序結果連接產物經轉化后測序，由北京華大基因科技序列測定片段長度約為500bp，測序結果如下
GGCAAAGGAGTCACTCCAACCCCTGTGACATACCTATGTTGCTTCGGCGGGCCGTCCCGCGGCGCGCCCACGTGGCGTGACCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGGGACCCAAACTCTTGCCTTTTTAGTGTCTCCTCTGAGTGGCATAAGCAAAAATAAACAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCAGCCCCCGTTCGCGGGGCGCTGGCGTTGGGGATCGGCCGTCCTCGCGGCGGCCGGCCCCGAAACACAGTGGCGGTCTCCTGCAGACTCCCCTGCGTAGTAGCACTACCTCGCAGAAGGGACGAGCGGGCTGGCCACGCCGTAAAACCCCCAACTTCTCCAGGTTGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAA
序列提交到Gen-Bank數據庫，進行BLAST比對，結果顯示該菌株ITS序列與Acremonium sp. NJM 0672、Acremonium sp. NJM 0567 同源性為 100% (兩者均分離于日本海域真菌感染的蝦蛄體內)；與Emericellopsis maritima strain、 Emericellopsismaritima strain、Emericellopsis sp. r454、Emericellopsis sp. s030 同源性為 99%(Emericellopsis為已發現具有有性階段的Acremonium種類)。結合形態學鑒定結果，將該菌確定為枝頂孢霉 BH-0531 (Acremonium cephaIosporium) ㈢菌種的分離、篩選1.菌種的分離、純化
采自渤海(經度E 117° 53' 23.2〃，緯度N 38° 55' 51.0")底層海水的樣本經0.45 μ m硝酸纖維素濾膜(f50，市售)過濾后，將濾膜置于海水固體培養基上，于260C恒溫培養。采用挑單孢法，將其轉入新的平板培養。此過程反復進行，直至菌落純化為止。所述的海水固體培養基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，海水600mL/L，蒸餾水 400mL/L，瓊脂 20 g/L。2.菌種的篩選(2)菌種的篩選
1)將上述分離純化的菌種接種于液體培養基中進行搖瓶發酵培養，發酵培養后的培養液經孔徑為0. 22Mffl濾膜(市售)過濾所收集的濾液即為發酵濾液；
其中所述的液體培養基是指查氏液體培養基=NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, KCl 0. 5 g/L, MgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0.01 g/L，蔗糖30 g/L，PH自然；或海水液體培養基葡萄糖IOg/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，海水600mL/L，蒸餾水400mL/L ；
2)使用M孔細胞培養板，在每孔中加入ImL發酵濾液和100μ L線蟲懸液(平均1500頭線蟲/100 μ L)，^TC靜置3d，5d后，解剖鏡下統計線蟲死亡率；分離篩選后獲得具有殺線蟲功用的來自渤海灣水域的殺線蟲枝頂孢霉菌株BH-0531，其毒力級別達到死亡率>90% A的級；培養條件為轉速120r/min，初始pH6. 5J6°C發酵96h。該菌種已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC-M45。3.培養條件的優化
63. 1初始pH對產生殺線蟲活性物質產生的影響結果如表1所示，結果表明初始PH值在6. 5以下時產物活性隨pH值升高而升高，pH為6. 5到7. 5時達到活性較高并且相對穩定，PH到8后產物活性又有下降。 表1初始pH對菌株生長和殺線蟲活性物質形成的影響
初始PH值菌體干重(g/L)3d后線蟲死亡率(％)5d后線蟲死亡率(％)42. 4±0. 261. 0774. 364. 53. 3±0. 261. 1274. 5853. 3±0. 266. 6775. 125. 53. 4±0. 274. 6479. 5663. 7±0. 283. 6588. 776. 53. 9±0. 285. 5093. 5573. 4±0. 285. 8793. 177. 53. 0±0. 290. 1095. 6182. 9±0. 275. 9686. 358. 52. 8±0. 264. 3275. 8392. 5±0. 249. 3260. 28對照1. 413. 25
3. 2溶解氧對BH-0531菌株生長和產生殺線蟲活性物質產生的影響
通過采用不同的搖床轉速和不同的裝液量研究溶解氧對BH-0531菌株生長和殺線蟲
活性物質形成的影響。結果如表2、表3所示
表2搖床轉速對菌株生長和殺線蟲活性物質形成的影響
權利要求
1.一種渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株(JcreMWiWB cephalosporium) BH-0531菌株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為 CGMCC-5445。
2.—種權利1所述渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株BH-0531的篩選方法，其特征在于(1)菌種的分離、純化樣本來自渤海灣的底層海水，經孔徑0.45 μ m硝酸纖維素濾膜(f50)過濾后，將濾膜置于海水固體培養基上，于沈！恒溫培養獲得菌落，采用挑單孢法，將其轉入新的平板培養，此過程反復進行，直至菌落純化為止；所述的海水固體培養基葡萄糖10g/L，蛋白胨 2g/L，酵母膏 2g/L，海水 600mL/L，蒸餾水 400mL/L，瓊脂 20 g/L ；(2)菌種的篩選1)將上述分離純化的菌種接種于液體培養基中進行搖瓶發酵培養，發酵培養后的培養液經孔徑為0. 22Mffl濾膜過濾，收集得到發酵濾液；其中所述的液體培養基是指查氏液體培養基=NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, KCl 0. 5 g/L, MgSO4 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L，蔗糖 30 g/L, PH 自然；或海水液體培養基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，海水600mL/L，蒸餾水 400mL/L ；培養條件為接種量2 X IO6的孢子懸液，轉速120r/min，初始pH6. 5J6°C發酵96h ；2)使用M孔細胞培養板，在每孔中加入ImL發酵濾液和100μ L線蟲懸液(平均1500 頭線蟲/100 μ L)，^TC靜置3d，5d后，解剖鏡下統計線蟲死亡率；分離篩選后獲得具有殺線蟲功用的來自渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株BH-0531，其毒力級別達到死亡率彡90%的A級；(3)菌種培養條件的優化優化的培養基為去皮馬鈴薯150g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，海水含量600ml/L ； 其中去皮馬鈴薯150g/L指的是去皮馬鈴薯150g置400mL蒸餾水中煮汁，取汁液，再定容至 400mL ；優化的培養條件為接種量2X IO6的孢子懸液，轉速120r/min，初始pH6. 5J6°C發酵 96h ；培養得到殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株。
3.權利1所述渤海灣殺線蟲絲狀海洋真菌枝頂孢霉菌株BH-0531菌株在制備作為生物活性物質用于農用殺蟲劑、生物農藥和抗生素發酵生產中的應用。
4.權利2所述的應用，其中所述的農用殺蟲劑、生物農藥和抗生素對象為植物病原線蟲、植物病原真菌和植物病原細菌。
全文摘要
本發明提供一種分離自渤海灣水域的枝頂孢霉菌株BH-0531及其篩選和應用。該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC-5445。該菌種由采自渤海灣底層海水的樣本中分離，經篩選、鑒定獲得。本發明分離篩選的BH-0531菌株屬于枝頂孢霉屬(舊稱頭孢霉屬)具有海洋微生物的生長溫度低和高鹽條件下生長的特性，具有產生殺線蟲活性代謝產物的能力，所產生的殺線蟲物質具有很好的熱穩定性和水溶性，實驗條件下殺線蟲活性可達94%以上，可用于殺線蟲劑和抗生素等生物活性物質的發酵生產。
文檔編號C12P1/02GK102559509SQ201110347979
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月7日 優先權日2011年11月7日
發明者馮欣, 史曉訊, 孫建華, 孫金生, 孟凡歡, 孟慶恒 申請人:天津師范大學