專利名稱：一種培養胰腺干/祖細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞的培養方法，尤其是一種高效誘導胰腺干/祖細胞分化為內分泌細胞的培養方法。
背景技術：
組織細胞培養是生物學中最為重要的實驗技術，應用極為廣泛，促進著眾多前沿科學如分子生物學、基因工程、蛋白質工程等的發展。組織細胞培養的方式主要分為三類 懸滴培養、單層培養和立體培養。懸滴培養法20世紀初由Harrison和Carrel創立單蓋片懸滴培養法，1924年 Maximow改良為雙蓋片懸滴培養法。懸滴培養的優點是細胞生長在近似于立體的環境中，缺陷是細胞生長的空間狹小、氣體不足和營養成分少，限制細胞的生長。單層培養法從20世紀40年代末期開始，由Dulbecco為首的學者們，改用人工合成培養基加胎牛血清作為培養液和把細胞接種在培養瓶中培養，能使細胞生長為單層，而成為單層培養。單層培養具有傳代方便、易于應用各種方法觀察和進行研究，以至成為世界至今仍普遍應用的經典培養方法。單層培養的細胞只有長和寬二維結構，失去了原體內時的立體形態，致使細胞不能充分表達相應基因產物和發生分化。立體培養法目前，立體培養尚在完善和發展中。這種方法的優點為將細胞培養在特殊容器中，能隨時更新培養液、提供營養物質和排除代謝產物；為培養細胞提供有與體內相似的支架系統，建成與原體內相似的生存環境；為培養細胞提供特定促細胞增殖生長和分化因子。2007年，我國糖尿病的發病率已增加至5%，糖尿病及其并發癥的死亡率已上升至第三位。隨著胰島移植技術的發展，胰島移植成為徹底治療糖尿病最有希望的方法。但是，供體胰腺的不足限制了胰島移植的廣泛開展，因此，迫切需要尋找β細胞的新來源。胰腺干/祖細胞可分化為β細胞，因此胰腺干/祖細胞的分離、培養和誘導分化將為細胞治療糖尿病提供了基礎。目前，胰腺干/祖細胞仍缺乏特異的表面標志，研究者正在嘗試尋找。應用特異的表面標志，流式細胞儀或免疫磁珠分選可以簡單，有效地分離胰腺干/祖細胞。但是，分離胰腺干/祖細胞后面臨的最大困難是得到的細胞數比較少，大部分研究者采用常規的培養方法如單層培養或三維培養，誘導其分化為β細胞的效率低，而且需要大量細胞因子的誘導。
發明內容
為了解決現有胰腺干/祖細胞培養技術中存在的效率低、細胞因子誘導劑量大、 誘導后的β細胞數量少功能低下等缺陷，本發明提供了一種解決方案，將懸滴培養法和立體培養法相結合并改進，建立了一種培養胰腺干/祖細胞的方法。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種培養胰腺干/祖細胞的方法，包括以下步驟
(1)將胰腺干/祖細胞接種于微孔培養板中，接種結束后，立即快速將接種板翻轉，使接種的細胞懸液和培養液的混合物在接種板表面形成吸附于接種板的向下的懸滴， 而不至于導致液體滴落或濺出；(2)在懸滴狀態下培養至細胞形成細胞球之后，將細胞球轉移至漂浮的培養膜上繼續培養至形成具有生理學功能的結構。具體地說，包括以下步驟(1)解剖顯微鏡下分離孕12. 5-17. 5天胚胎小鼠的胰腺，加入終濃度為250U/ml的膠原酶IV 200μ 1，37°C孵育30min，加入PRMI-1640完全培養基終止消化，用Iml注射器反復吹打胚胎胰腺直至無明顯沉淀，100目的濾網過濾后，制備胰腺細胞的單細胞懸液；(2)調整細胞懸液的濃度為(1-5)Χ103/μ1，取細胞懸液接種于底面積為 0. 013cm2的微孔培養板中，20-30 μ 1/孔，接種結束后，快速把培養板反轉，細胞間相互緊密接觸形成一個細胞球；(3)在倒置的微孔培養板培養18_24h后，在解剖顯微鏡下把細胞球轉移至漂浮的直徑為25mm的LCR膜上，直徑為35mm的小培養皿中加入anlPRMI-1640完全培養基，LCR膜漂浮于培養基中，細胞球體在漂浮的LCR膜上培養六天，胚胎胰腺干細胞逐漸分化為內、外分泌細胞，細胞中含大量的分泌顆粒，培養7天后，進行免疫組織化學檢測成熟胰腺細胞。所述PRMI-1640完全培養基中按體積比加入10 %胎牛血清，100U/ml青霉素， 100ug/ml鏈霉素，非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺。本發明的有益效果是本發明中的懸滴培養技術，不僅適合少量細胞的培養，能在體外誘導胰腺干細胞高效分化為內分泌細胞，而且不需要誘導因子，可以使胰腺細胞之間的接觸更加緊密，為胰腺細胞的生長、增殖提供良好的三維環境。對比組織材料提供的三維培養技術，懸滴培養法簡單方便，不需要特定的生物材料，而且細胞間的接觸更為緊密，能夠更好地模擬體內生長環境。由于不同種類干細胞之間具備了生物學特性和生長方式的相似性，故而此培養方法不僅可以用于胰腺細胞的培養，也適用于其它種類干細胞的培養。
圖1懸滴培養的示意圖；圖加細胞剛接種于培養板的照片；圖2b細胞接種于培養板后在懸滴中培養1天后的照片；圖3細胞球于漂浮的膜上培養的示意圖；圖4細胞球于漂浮的膜上培養過程中形態的變化；圖5細胞球于漂浮的膜上培養過程中胰腺細胞標志表達的變化。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明本發明的具體實施方式
如下，但本發明的實施并不局限于以下實施例解剖顯微鏡下分離胚胎小鼠(孕12. 5-17. 5天)的胰腺，加入終濃度為250U/ml的膠原酶IV 200 μ 1，37°C孵育30min，加入PRMI-1640完全培養基(添加10%胎牛血清，IOOU/ ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，1 %非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺)終止消化，用Iml注射器反復吹打胚胎胰腺直至無明顯沉淀，100目的濾網過濾后，制備胰腺細胞的單細胞懸液。調整細胞懸液的濃度為1-5 X IO3/μ 1，取細胞懸液接種于底面積為0. 013cm2的微孔培養板中 (Nunclon Microwell Terasaki-Style Plates)，20-30 μ 1/孔，接種結束后，快速把培養板反轉，由于表面張力的作用，培養液不會流下來。由于重力作用，細胞間相互緊密接觸形成一個細胞球(圖1，幻。在倒置的微孔培養板培養18_24h后，在解剖顯微鏡下把細胞球轉移至漂浮的直徑為25mm的LCR膜上。直徑為35mm的小培養皿中加入^il PRMI-1640完全培養基，LCR膜漂浮于培養基中(圖3)。細胞球體在漂浮的LCR膜上培養六天，培養過程中細胞球的變化如圖4。盡管在培養過程中細胞球體的體積變化不大，但隨著培養天數的增加， 其密度逐漸增加。因為隨著培養天數的增加，胚胎胰腺干細胞逐漸分化為內、外分泌細胞， 細胞中含大量的分泌顆粒。培養7天后，免疫組織化學檢測成熟胰腺細胞的標志發現細胞球高表達胰島素、胰高血糖素以及羧肽酶，而且胰島素陽性細胞和胰高血糖素陽性細胞聚集在一起形成類似胰島的結構。細胞球培養過程胰島素的表達逐漸升高，而胰高血糖素的表達先下降后升高。因為胰高血糖素被認為表達于胰腺干細胞。隨著胰腺干細胞分化胰高血糖素表達逐漸下降，第3天時表達最低。但是，隨著成熟α細胞出現，胰高血糖素表達逐漸增加。細胞球培養過程中胰島素和胰高血糖素的表達模式與體內胚胎胰腺發育過程中相一致(圖5)。 綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。
權利要求
1.一種培養胰腺干/祖細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將胰腺干/祖細胞接種于微孔培養板中，接種結束后，立即快速將接種板翻轉，使接種的細胞懸液和培養液的混合物在接種板表面形成吸附于接種板的向下的懸滴，而不至于導致液體滴落或濺出；(2)在懸滴狀態下培養至細胞形成細胞球之后，將細胞球轉移至漂浮的培養膜上繼續培養至形成具有生理學功能的結構。
2.根據權利要求1所述的培養胰腺干/祖細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)解剖顯微鏡下分離孕12.5-17. 5天胚胎小鼠的胰腺，加入終濃度為250U/ml的膠原酶IV 200μ 1，37°C孵育30min，加入PRMI-1640完全培養基終止消化，用Iml注射器反復吹打胚胎胰腺直至無明顯沉淀，100目的濾網過濾后，制備胰腺細胞的單細胞懸液；(2)調整細胞懸液的濃度為(1-5)X IO3/μ 1，取細胞懸液接種于底面積為0.013cm2的微孔培養板中，20-30 μ 1/孔，接種結束后，快速把培養板反轉，細胞間相互緊密接觸形成一個細胞球；(3)在倒置的微孔培養板培養18-24h后，在解剖顯微鏡下把細胞球轉移至漂浮的直徑為25mm的LCR膜上，直徑為35mm的小培養皿中加入anlPRMI-1640完全培養基，LCR膜漂浮于培養基中，細胞球體在漂浮的LCR膜上培養六天，胚胎胰腺干細胞逐漸分化為內、外分泌細胞，細胞中含大量的分泌顆粒，培養7天后，進行免疫組織化學檢測成熟胰腺細胞。
3.根據權利要求1所述的培養胰腺干/祖細胞的方法，其特征在于，所述PRMI-1640完全培養基中按體積比加入10%胎牛血清，100U/ml青霉素，lOOug/ml鏈霉素，非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺。
全文摘要
本發明公開了一種培養胰腺干/祖細胞的方法，包括以下步驟將胰腺干/祖細胞接種于微孔培養板中，接種結束后，立即快速將接種板翻轉，使接種的細胞懸液和培養液的混合物在接種板表面形成吸附于接種板的向下的懸滴，而不至于導致液體滴落或濺出；在懸滴狀態下培養至細胞形成細胞球之后，將細胞球轉移至漂浮的培養膜上繼續培養至形成具有生理學功能的結構。本發明的懸滴培養法簡單方便，不需要特定的生物材料，而且細胞間的接觸更為緊密，能夠更好地模擬體內生長環境。
文檔編號C12N5/071GK102363764SQ20111034455
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者韓忠朝, 馬鳳霞 申請人:中國醫學科學院血液病醫院(血液學研究所)