基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法

專利名稱：基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳領(lǐng)域，涉及一種基于磁分離與引物延伸的以化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法。本發(fā)明可應(yīng)用于遺傳異常的發(fā)現(xiàn)和識別，具體而言，本發(fā)明特別用于微觀和亞微觀基因組結(jié)構(gòu)變異的發(fā)現(xiàn)，包括缺失、重復(fù)及大片段的多態(tài)性，以便計(jì)量與正常和疾病狀態(tài)相關(guān)的基因組變化。本發(fā)明也可應(yīng)用于其他的基因定量研究。
背景技術(shù)：
遺傳變異是生命的基本特征，也是疾病的重要指征。目前，以第三代遺傳標(biāo)記—— 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)為基礎(chǔ)的全基因組關(guān)聯(lián)分析 (genome-wide association studies, GffAS)已經(jīng)成為研究常見復(fù)雜疾病遺傳易感性的主要手段。隨著DNA芯片技術(shù)的逐步發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)，在人類基因組中存在大量大于1Kb 但小于3Mb的DNA片段多態(tài)，包括片段的插入、缺失和/或重復(fù)，及其互相組合衍生出的復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)變異。這種現(xiàn)象被稱作拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV),或拷貝數(shù)多態(tài)(copy number polymorphism，CNP)?？截悢?shù)變異在人類基因組中的存在最早于2004年分別由Iafrate和Sebat各自所在的研究小組報(bào)道。隨后，Redon等人于2006年在HapMap 計(jì)劃的270名健康供者中鑒定得到1447個(gè)CNV區(qū)域(CNV region, CNVR)，它們覆蓋了 1 (300Mb)的人類基因組，并且和疾病致病/易感基因位點(diǎn)相關(guān)。這些結(jié)果提示，CNVs可能像 SNPs 一樣影響著基因的表達(dá)、表型的變異和適應(yīng)，也是一種重要的疾病易感變異，能引發(fā)疾病或增加復(fù)雜疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此，在隨后的幾年中，多種常見復(fù)雜疾病的全基因組CNVs 分析結(jié)果相繼出現(xiàn)，包括CNVs與自閉癥、CNVs與精神分裂癥、CNVs與癌癥等等。舉例而言， 已知胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制涉及多因素、多步驟，其中CNVs導(dǎo)致的抑癌基因的失活和癌基因的激活在胃癌的發(fā)生和演變過程中擔(dān)當(dāng)重要角色。近年的研究表明，不同的CNVs與胃癌的分期、分型、淋巴結(jié)和血液轉(zhuǎn)移等存在一定相關(guān)性。從細(xì)胞遺傳學(xué)角度來解釋，出現(xiàn)高頻率丟失的部位很可能存在與胃癌密切相關(guān)的抑癌基因，而出現(xiàn)高頻率重復(fù)的部位則可能存在相關(guān)的癌基因，CNVs所導(dǎo)致的抑癌基因失活和癌基因過表達(dá)很可能對胃癌的發(fā)生具有啟動(dòng)作用。這些研究結(jié)果提示研究人員更深入探尋CNVs與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性，為胃癌的早期診斷、治療和預(yù)后提供新的判斷依據(jù)。對于CNVs與其他復(fù)雜疾病的關(guān)聯(lián)性研究也是立足于此。自CNVs于2004年被報(bào)道，隨即有研究者建立了 “基因組變異數(shù)據(jù)庫”(Database of Genomic Variants，DGV)，收錄人類基因組結(jié)構(gòu)變異信息，為廣大遺傳學(xué)研究人員提供便捷的查詢基因組結(jié)構(gòu)變異的渠道。根據(jù)DGV的統(tǒng)計(jì)，截至2010年11月2日，基于NCBI build 36參考基因組序列發(fā)現(xiàn)的CNVs總共為66，741個(gè)，由此形成的CNVR共12，963個(gè)，覆蓋35. 07%的人類基因組，覆蓋長度達(dá)1，000 Mb以上，這是目前任何一種遺傳標(biāo)記都不能比擬的。尤其是，DGV收錄的信息每年呈倍數(shù)增長，說明對于人類基因組中>lKb之結(jié)構(gòu)變異的研究越來越受到關(guān)注，該種變異的重要程度不言而喻。目前存在的研究CNVs的技術(shù)可劃分為兩類，一類是掃描全基因組以發(fā)現(xiàn)新CNVs 的技術(shù)，主要包括比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)、代表性寡核苷酸微陣列分析(representational oligonucleotide microarray analysis, ROMA)、 SNP (single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)芯片；另一類是針對已知CNVs 進(jìn)行高通量檢測的技術(shù)，主要包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative PCR)、多重可擴(kuò)增探針雜交技術(shù)(multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH)、多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)0 其中，MLPA是由荷蘭學(xué)者khouten等人于2002年建立。它利用簡單的雜交、連接、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴(kuò)增反應(yīng)，于單一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測最多40 個(gè)不同的核苷酸序列的拷貝數(shù)變化。其原理如下MLPA方法中的探針組由兩部分構(gòu)成，一組探針由與靶基因特異性結(jié)合的序列和合成的通用引物序列構(gòu)成，另一組探針則由與靶基因特異性結(jié)合的序列、來源于M13載體的通用引物序列以及填充于兩者之間的不同長度的寡核苷酸片段構(gòu)成；兩組探針若與基因組DNA模板完全互補(bǔ)配對則能夠被連接酶連接，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果判讀基因組中拷貝數(shù)的變化。雖然檢測之前經(jīng)過了 PCR 擴(kuò)增過程，但由于使用的是通用引物，不存在不同核酸序列之間擴(kuò)增效率的差異，因此能夠定量基因組中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)差異。最初的MLPA技術(shù)以片段長度來標(biāo)記不同核酸序列，通過毛細(xì)管電泳解碼標(biāo)記從而判讀基因組中目標(biāo)核酸序列的拷貝數(shù)差異。之后更發(fā)展了多種基于MLPA之連接反應(yīng)為根本原理檢測特定CNVs的技術(shù)，主要為提高檢測的通量， 而對于通量的提高則在于編碼與解碼技術(shù)的改進(jìn)，如發(fā)展了序列標(biāo)簽編碼解碼技術(shù)、質(zhì)譜編碼解碼技術(shù)等。然而，目前基于MLPA技術(shù)檢測CNVs之方法的共同局限性在于其昂貴的價(jià)格，而造成其價(jià)格昂貴的主要原因之一便在于它的核心原理——獲取核苷酸序列拷貝數(shù)信息時(shí)需要使用特殊的連接酶(Ligase-65)對目標(biāo)片段進(jìn)行連接?；蚪M結(jié)構(gòu)變異與疾病、藥物、環(huán)境易感性明顯相關(guān)，但是人類基因組將近3( 的核苷酸數(shù)量限制了全基因組測序作為常規(guī)檢測遺傳變異的手段。因此，需要發(fā)展便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測遺傳變異的技術(shù)為人類健康提供基因組信息。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題CNVs研究的關(guān)鍵問題在于對基因拷貝數(shù)的真實(shí)定量，即對于基因組中核苷酸序列拷貝數(shù)信息的獲取。本發(fā)明的目的在于解決上述所提到的使用特殊連接酶而造成獲取核苷酸序列拷貝數(shù)信息時(shí)成本高昂的問題，提出了一種能大大降低成本的基于磁分離的獲取核苷酸序列拷貝數(shù)信息的方法，在獲取核苷酸序列拷貝數(shù)信息后檢測化學(xué)發(fā)光以分析基因拷貝數(shù)變異，從而為推廣CNVs檢測成為常規(guī)遺傳變異檢測項(xiàng)目奠定基礎(chǔ)。技術(shù)方案基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法，1)制備適合于獲取核酸序列拷貝數(shù)信息的磁性介質(zhì)；2)設(shè)計(jì)能與目標(biāo)核酸序列特異性結(jié)合的引物與探針，探針5’端的修飾對應(yīng)1)所述磁性介質(zhì)上所修飾之功能化基團(tuán)，之后以產(chǎn)物捕獲方式獲取目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息，產(chǎn)物捕獲方式指先進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，再利用磁性介質(zhì)表面連接的特異性探針與延伸反應(yīng)產(chǎn)物之間的堿基互補(bǔ)配對捕獲延伸得到的核酸片段；3)根據(jù)引物設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)確定Tm值，根據(jù)Tm值確定退火溫度，加入雜交緩沖溶液，經(jīng)過變性與退火過程，使引物與變性成單鏈的DNA模板充分結(jié)合；4)加入延伸反應(yīng)緩沖溶液，進(jìn)行一個(gè)循環(huán)后結(jié)束反應(yīng)，再加入已制備的連接有特異性探針的磁性介質(zhì)與延伸產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而捕獲目標(biāo)核酸片段至磁性介質(zhì)；5)磁分離，對磁性介質(zhì)進(jìn)行清洗，即得到獲取了模板中目標(biāo)核酸片段拷貝數(shù)信息的磁性介質(zhì)；6)對反映至磁性介質(zhì)上的模板中的目標(biāo)基因與內(nèi)參基因核酸片段進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，比較目標(biāo)基因/內(nèi)參基因核酸片段化學(xué)發(fā)光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標(biāo)基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數(shù)變化信息。所述磁性介質(zhì)為體現(xiàn)磁學(xué)性質(zhì)的物體。所述體現(xiàn)磁學(xué)性質(zhì)的物體為具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)構(gòu)成的物體或以具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)為部件的物體。所述延伸反應(yīng)體系為常規(guī)使用的PCR緩沖體系，所使用的酶為普通的Taq DNA聚合酶、Vent_DNA聚合酶或De印Vent_ DNA聚合酶。一種基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法，制備步驟為 a.磁性顆粒制備，采用溶劑熱法制備直徑在300nm左右的!^e3O4磁性顆粒稱取1.35 g
的狗(13*6!120、3.6 g的醋酸鈉以及1.0 g聚乙二醇溶解于40 mL乙二醇中，磁力攪拌溶解， 形成黃褐色膠體；將膠體轉(zhuǎn)移至四氟乙烯反應(yīng)釜，密封，置于200°C烘箱中反應(yīng)8小時(shí)；反應(yīng)完成后以乙醇與去離子水清洗，烘干后得!^e3O4磁性顆粒；用100 mL 0. Imol鹽酸浸泡狗304 磁性顆粒1小時(shí)，超聲分散30分鐘；再重新分散于乙醇體積濃度80%的乙醇-水混合液中， 以25°C、280轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?，同時(shí)加入200 μ L正硅酸乙酯(TE0S)，反應(yīng)1小時(shí)；以乙醇、去離子水交叉洗滌；將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨，超聲30分鐘，在25°C、300轉(zhuǎn)/分條件下攪拌，同時(shí)加入1 mL TE0S，反應(yīng)3小時(shí)后，以乙醇、 去離子水交叉洗滌數(shù)次，最后以乙醇分散，于4°C保存；制備得到核-殼結(jié)構(gòu)的!^e3O4OSiA 復(fù)合顆粒；磁性納米顆粒的氨基化；將上述制得的!^3O4OSiA復(fù)合納米磁性顆粒磁分離，加入至乙醇/水混合溶液中并超聲分散，然后將10 μ L 8-aminopyrene-l, 3，6-trisulfonic acid trisodium salt (APTS)滴加到以上混合溶液中，并在室溫下振蕩攪拌7小時(shí)，利用外加磁場將APTS修飾的磁性顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，用乙醇溶液對其清洗5次，磁分離，再用二甲基甲酰胺(N，N-dimethyl formamide, DMF)清洗5次，最后以5 mg/mL的濃度分散于DMF中，待用；氨基化磁性納米顆粒的羧基化；取分散于DMF溶液中的氨基化SiO2/ 狗304磁性納米顆粒(5 mg/mL)，逐滴加入到等體積丁二酸酐(Succinic anhydride, SA)濃度為0. 001的DMF溶液中，室溫下反應(yīng)M小時(shí)，用水洗滌數(shù)次后磁分離，加入雙蒸水定容至 10 mg/mL，即得到功能性的羧基化磁珠；將上述羧基化磁珠(10 mg/mL)用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, MES, 25mM, pH 6)反復(fù)清洗，磁分離，加入以MES溶液稀釋的氨基化探針(100 μ Μ)至清洗過的磁珠中，混合均勻后室溫下溫和旋轉(zhuǎn)孵育30分鐘，立刻加入冷的以MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨 SMS )-3-—MI^ci-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, EDC, 10
mg/mL)至磁珠中混合均勻，再以MES溶液補(bǔ)足體積至50 μ L。在4°C條件下旋轉(zhuǎn)孵育2小時(shí)，每20分鐘搖勻一次，磁分離后吸去上清，將磁珠于Tris (50 mM,pH 7. 4)溶液中孵育15 分鐘以中和沒有反應(yīng)的活化的羧基基團(tuán)，再以Tris (50 mM,0. 1 % Tween-20)清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液(g/mL :0. 1%)封閉磁珠；即得到了連接有特異性探針的功能化磁珠；
b.設(shè)計(jì)一對能與GAPDH、GSTTl與GSTMl基因特異性結(jié)合的引物與探針，探針5’端以氨基修飾，通過氨基-羧基相互反應(yīng)將探針固定至磁性顆粒表面；
c.延伸加入IOXBuffer 2 μ L.25 mM Mg2+ 2μ L,2. 5 mM dNTP 1.5 μ L、上下游引物各2. 5 μ L，人工合成的上述DNA模板2. 5 μ L、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補(bǔ)足體積至20 μ L，將反應(yīng)混合物置于PCR儀中；PCR參數(shù)94°C 5分鐘；95°C 30秒，54°C 30秒， 720C 1分鐘，1個(gè)循環(huán)；將得到的雙鏈延伸產(chǎn)物進(jìn)行變性，通過堿基互補(bǔ)配對原則將變性后的單鏈延伸產(chǎn)物與連有特異性探針的磁性顆粒雜交，然后將連有單鏈DNA的磁性顆粒磁分離，進(jìn)行清洗；從而得到反映了目標(biāo)基因拷貝數(shù)信息的磁性介質(zhì)；
d.對反映至磁性介質(zhì)上的模板中的目標(biāo)基因與內(nèi)參基因核酸片段進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測， 比較目標(biāo)基因/內(nèi)參基因核酸片段化學(xué)發(fā)光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標(biāo)基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數(shù)變化信息。所述磁性顆粒表面包被一層SiA外殼。所述包被方法為用100 mL 0. Imol鹽酸浸泡!^e3O4顆粒1小時(shí)，超聲分散30分鐘；再重新分散于體積濃度80%的乙醇-水混合液中，以25°C、280轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?，同時(shí)加入 200 μ L SiO2 28. 4%wt的TE0S，反應(yīng)1小時(shí)，以乙醇、去離子水交叉洗滌數(shù)次；將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨，超聲30分鐘，在25°C、300轉(zhuǎn)/ 分條件下攪拌，同時(shí)加入1 mL TE0S，反應(yīng)3小時(shí)后，以乙醇、去離子水交叉洗滌數(shù)次，最后以乙醇分散，于4°C保存。所述化學(xué)發(fā)光檢測為進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)過程中檢測得到的光信號，所使用的化學(xué)發(fā)光體系包括魯米諾、光澤精、過氧化草酸酯、1，2_ 二氧雜環(huán)丁烷類、吖啶酯或三(2，2’ -聯(lián)吡啶)釕(III )。具體而言，本發(fā)明通過引物延伸反應(yīng)，將基因組中待測核酸片段的拷貝數(shù)信息反映至磁性介質(zhì)，再利用磁性介質(zhì)易于分離的特性，經(jīng)過磁分離后檢測化學(xué)發(fā)光以分析待測模板中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)變化情況。該方法具體技術(shù)過程如下
1)在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，以功能化的I^e3O4磁性顆粒作為磁性介質(zhì)來獲取 DNA模板中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息。具體而言，制備!^e3O4磁性顆粒，在其上包被功能化材料并修飾功能化基團(tuán)。所述制備狗304磁性顆粒的方法包括共沉淀法、水熱法、高溫分解法、微乳液法、溶膠-凝膠法，以及其他物理或化學(xué)方法。所述包被于狗304磁性顆粒表面的功能化材料包括聚合物(葡聚糖及其衍生物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯等)、二氧化硅、金屬等。所述修飾于功能化材料表面的功能化基團(tuán)包括羧基修飾、氨基修飾、鏈親和素修飾等。這些對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯然的。所列舉的制備、包被與修飾狗304磁性顆粒的材料和方法只是舉例說明本發(fā)明，不能以任何方式限制本發(fā)明的范圍。2)探針設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)一對能與目標(biāo)核酸序列特異性結(jié)合的探針，探針的5’端修飾根據(jù)前述磁性顆粒上所修飾功能化基團(tuán)的不同而不同。利用磁性顆粒與探針5’端修飾基團(tuán)之間的反應(yīng)將探針固定于磁性顆粒上。3)延伸。加入延伸反應(yīng)溶液，成分包括常規(guī)使用的PCR緩沖體系，將反應(yīng)混合物置于PCR儀中進(jìn)行引物延伸反應(yīng)。根據(jù)引物設(shè)計(jì)的相關(guān)數(shù)據(jù)確定Tm值，根據(jù)Tm值確定退火溫度，從而確定反應(yīng)參數(shù)；根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的長度確定延伸反應(yīng)時(shí)間。進(jìn)行一個(gè)循環(huán)后結(jié)束反應(yīng)，對雙鏈進(jìn)行變性。所述常規(guī)使用的PCR緩沖體系中所使用的酶為普通的Taq DNA聚合酶、Vent_ DNA聚合酶、De印Vent_ DNA聚合酶等。這對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯然的， 所列舉的酶與PCR反應(yīng)體系只是舉例說明本發(fā)明，不能以任何方式限制本發(fā)明的范圍。4)雜交。將3)中得到的延伸反應(yīng)產(chǎn)物與2)中制備的連接有特異性探針的磁性顆?；旌?，加入雜交緩沖溶液，使兩者充分結(jié)合。上述例舉的方法只對待測核酸片段進(jìn)行了一次延伸，在真實(shí)反應(yīng)基因組中待測核酸序列拷貝數(shù)水平的同時(shí)，對于低豐度基因的拷貝數(shù)檢測可能靈敏度不夠，因此可結(jié)合PCR 方法，設(shè)計(jì)通用接頭與通用引物對延伸產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、得到一定豐度的目標(biāo)核酸片段后再進(jìn)行檢測。此為對本發(fā)明核心原理“延伸反應(yīng)”的技術(shù)發(fā)展，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯然的，不能以任何方式限制本發(fā)明的范圍。通過前述四個(gè)步驟得到了已獲取DNA模板中目標(biāo)核酸片段拷貝數(shù)信息的磁性顆粒，即對DNA模板中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息進(jìn)行了預(yù)處理。接下來可對磁性顆粒采用不同的檢測方法進(jìn)行檢測，根據(jù)此時(shí)檢測方式的不同，前述步驟幻、；3)和4)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)步驟方面都有相應(yīng)調(diào)整。本發(fā)明以化學(xué)發(fā)光檢測方式，對拷貝數(shù)變異進(jìn)行定量分析。步驟3)在延伸反應(yīng)緩沖體系中加入經(jīng)過標(biāo)記的核苷酸單體，通過延伸反應(yīng)將其摻入至產(chǎn)物鏈，磁分離后，加入對應(yīng)標(biāo)記的酶，使酶與核苷酸單體充分結(jié)合，加入化學(xué)發(fā)光底物后，經(jīng)過酶催化反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)光，再進(jìn)行檢測。所述化學(xué)發(fā)光體系包括魯米諾 (Luminol )、光澤精(Lucigenin)、過氧化草酸酯(Peroxyoxalates)、1，2- 二氧雜環(huán)丁烷類 (Adamantyl Dioxtanes)、吖啶酯(Acridinium Exter)、三(2，2，-聯(lián)吡啶)釕(III) (tris (2，2’ -bipyridyl) ruthenium(III))等。這對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯然的，所列舉的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系只是舉例說明本發(fā)明，不能以任何方式限制本發(fā)明的范圍。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)
通過延伸引物反應(yīng)將基因組中待測核酸片段的拷貝數(shù)信息反映至磁性顆粒，再利用磁性顆粒易于分離的特性在分離后通過檢測延伸片段的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度確定待測核酸片段的拷貝數(shù)變化情況。該方法能真實(shí)再現(xiàn)待測核酸片段在基因組中的拷貝數(shù)變化情況，不同于經(jīng)過PCR擴(kuò)增后檢測終點(diǎn)產(chǎn)物的方法，也避免了實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測CNVs時(shí)需要優(yōu)先考慮的待測核酸片段與內(nèi)參核酸片段在引物擴(kuò)增效率方面的一致性；反映至磁性顆粒的檢測信號經(jīng)過了富集，同時(shí)還避免了雜交過程中其他核酸片段對于待測核酸片段信號的干擾，能夠有效降低本底，提高分辨率。


圖1為通過引物延伸后經(jīng)磁性顆粒捕獲產(chǎn)物再以化學(xué)發(fā)光檢測目標(biāo)核酸片段的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。
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圖2為功能化的狗304磁性顆粒。A.溶劑熱法制備的狗304磁性顆粒；B. SiO2包被的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合磁性顆粒。圖3以GAPDH基因?yàn)槔疽匀斯ず铣蒁NA片段為模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)的結(jié)果。 A.不同退火溫度條件下GAPDH基因片段的延伸結(jié)果；泳道0 :DNA分子量標(biāo)志DL2000 ；泳道1 引物對照；泳道2 模板對照；泳道3 :52°C為退火溫度的引物延伸結(jié)果；泳道4 為退火溫度的引物延伸結(jié)果；泳道5 :56°C為退火溫度的引物延伸結(jié)果；泳道6 :58°C為退火溫度的引物延伸結(jié)果；泳道7 :60°C為退火溫度的引物延伸結(jié)果。B.以人工合成的GAPDH 基因片段為模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)、再以連接有特異性探針之磁性納米顆粒捕獲延伸產(chǎn)物的電泳結(jié)果；泳道0 :DNA分子量標(biāo)志DL2000 ；泳道1 引物對照；泳道2-4 過程中所使用之洗脫緩沖液的電泳結(jié)果；泳道5 以人工合成的GAPDH基因片段為模板進(jìn)行引物延伸之產(chǎn)物經(jīng)磁分離再經(jīng)變性后的電泳結(jié)果；泳道6 模板對照。圖4以GAPDH基因?yàn)槔疽匀祟惢蚪MDNA為模板進(jìn)行引物延伸的結(jié)果。泳道 0 :DNA分子量標(biāo)志DL2000 ；泳道1 以人類基因組DNA為模板進(jìn)行引物延伸之產(chǎn)物的電泳結(jié)果；泳道2 人類基因組DNA模板對照；泳道3 引物對照。圖5為化學(xué)發(fā)光檢測目標(biāo)基因核酸片段的結(jié)果。A. GAPDH基因延伸產(chǎn)物及其空白對照的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值；B. GSTTl基因延伸產(chǎn)物及其空白對照的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值；C. GSTMl基因延伸產(chǎn)物及其空白對照的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述
本發(fā)明利用磁性顆粒易于分離的特性結(jié)合引物延伸反應(yīng)的方法，采用化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，公布了一種能夠低成本地獲取核酸序列拷貝數(shù)信息并進(jìn)行檢測的技術(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，以Fe53O4磁性顆粒作為媒介、以常規(guī)使用的PCR緩沖體系進(jìn)行核苷酸序列拷貝數(shù)信息的獲取，之后以化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行檢測。其實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示；延伸引物獲取核酸序列拷貝數(shù)信息后，經(jīng)連接有特異性探針的磁性顆粒捕獲摻入了標(biāo)記性核苷酸的產(chǎn)物片段，再加入對應(yīng)標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光的酶與底物進(jìn)行反應(yīng)而檢測化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。以下特定的實(shí)施例旨在更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例目的在于解釋本發(fā)明，而不應(yīng)理解為限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1以人工合成的GAPDH基因片段為模板進(jìn)行核酸序列拷貝數(shù)信息的獲取以人工合成的GAPDH基因片段為模板進(jìn)行核酸序列拷貝數(shù)信息獲取的實(shí)驗(yàn)過程如下 1)磁性顆粒制備。采用溶劑熱法制備直徑在300 nm左右的!^e3O4磁性顆粒。稱取1. 35 g 的!^eCl3 ·6Η20、3. 6 g 的醋酸鈉(NaAc)以及 1. 0 g聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG), 溶解于40 mL乙二醇中，磁力攪拌溶解，形成黃褐色膠體。將膠體轉(zhuǎn)移至四氟乙烯反應(yīng)釜， 密封，置于200°C烘箱中反應(yīng)8小時(shí)；反應(yīng)完成后以乙醇與去離子水清洗，烘干后得!^e3O4磁性顆粒樣品，如圖2A示。在制備的!^e3O4磁性顆粒表面包被一層幾十納米厚的二氧化硅(SiO2)外殼，可以得到具有更高穩(wěn)定性和生物相容性的核-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合顆粒。具體過程如下用100 mL0.1 mol鹽酸(HCl)浸泡!^e3O4顆粒1小時(shí)，超聲分散30分鐘。再重新分散于體積濃度80%的乙醇-水混合液中，以25°C、280轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢瑁瑫r(shí)加入200 μ L正硅酸乙酯 (TetraethyIorthosi 1 icate, TEOS, SiO2 28. 4%wt)，反應(yīng) 1 小時(shí)。以乙醇、去離子水交叉洗滌數(shù)次。將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)，超聲 30 分鐘，在 25°C、300 轉(zhuǎn) / 分條件下攪拌，同時(shí)加入1 mL TE0S，反應(yīng)3小時(shí)后，以乙醇、去離子水交叉洗滌數(shù)次，最后以乙醇分散，于4°C保存。制備得到的核-殼結(jié)構(gòu)的!^3O4OSiA復(fù)合顆粒如圖2B示。如上所述制備的!^3O4OSiA復(fù)合顆粒不僅磁效應(yīng)好，而且利用SW2包被后的顆粒表面存在大量羥基(-0H)，可以方便地修飾上各種功能化基團(tuán)。在本實(shí)施例中選擇在顆粒表面修飾羧基(-C00H)。具體修飾過程如下①磁性納米顆粒的氨基化；將上述制得的 Fe304iSi02復(fù)合納米磁性顆粒磁分離，加入至乙醇/水混合溶液中并超聲分散，然后將10 μ L 8-aminopyrene-l, 3, 6-trisulfonic acid trisodium salt (APTS)滴加到以上混合溶液中，并在室溫下振蕩攪拌7小時(shí)，利用外加磁場將APTS修飾的磁性顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，用乙醇溶液對其清洗5次，磁分離，再用二甲基甲酰胺(N，N-dimethyl formamide, DMF)清洗5次，最后以5 mg/mL的濃度分散于DMF中，待用；②氨基化磁性納米顆粒的羧基化；取分散于DMF溶液中的氨基化Si02/Fe304磁性納米顆粒(5 mg/mL)，逐滴加入到等體積丁二酸酐(Succinic anhydride, SA)濃度為0. 001M的DMF溶液中，室溫下反應(yīng)M小時(shí)，用水洗滌數(shù)次后磁分離，加入雙蒸水定容至10 mg/mL。③將上述羧基化磁珠(10 mg/ mL)用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate，MES，25mM，pH 6)反復(fù)清洗，磁分離，加入以MES溶液稀釋的氨基化探針(100 μ M) 至清洗過的磁珠中，混合均勻后室溫下溫和旋轉(zhuǎn)孵育30分鐘，立刻加入冷的以MES溶液溶解的 I- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-(3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylca rbodiimide，EDC，10 mg/mL)至磁珠中混合均勻，再以MES溶液補(bǔ)足體積至50 μ L。在4°C 條件下旋轉(zhuǎn)孵育2小時(shí)，每20分鐘搖勻一次，磁分離后吸去上清，將磁珠于Tris (50 mM, PH 7. 4)溶液中孵育15分鐘以中和沒有反應(yīng)的活化的羧基基團(tuán)，再以Tris (50 mM,0. 1 % wt Tween-20)清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液(g/mL :0. 1%)封閉磁珠。2)引物與探針設(shè)計(jì)。由于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases，GSTs) 的解毒與抗氧化活性，研究認(rèn)為此家族成員是重要的癌癥易感基因，在胃癌、結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)癌癥的研究中受到了廣泛地重視。其中GST θ 1 (GSTTl)，GST μ (GSTMl)基因由于同源序列的等位交換造成缺失、重復(fù)引起基因拷貝數(shù)的變化而導(dǎo)致酶活性的改變與癌癥的發(fā)生具有顯著相關(guān)性GSTT1與GSTMl缺失的基因型相較正常基因型具有癌癥發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)性。3-磷酸甘油酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為管家基因，是基因定量研究中常用的內(nèi)參基因。因此我們選用GSTTl與GSTMl基因作為目標(biāo)基因、GAPDH基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行CNVs分析平臺的開發(fā)研究。設(shè)計(jì)一對能與GAPDH (ID: 2597)、GSTTl (ID:四52)與 GSTMl (ID: 2944) 基因特異性結(jié)合的引物與探針，探針5’端以氨基修飾。引物序列如下。GAPDH: GGAAGATGGTGATGGGATTT ；GSTTl GTCCCAGTTACCTCTCCGTCA ；GSTMl :TCACTGGGGACACTCACAAA。 探針序列如下。GAPDH: TCAAGGCTGAGAACGGGAAG ；GSTTl :AGCCTTGAAGGACGGGGACT ；GSTMl TGGGCATGATCTGCTACAAT。
3)產(chǎn)物捕獲方式獲取DNA模板中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息。具體實(shí)驗(yàn)過程如下加入 IOXBuffer 2 μ L、Mg2+ (25 mM) 2 μ L、dNTP (2. 5 mM) 1.5 μ L、引物 2.5 μ L, 人工合成的DNA模板2. 5 yL、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補(bǔ)足體積至20 yL，將反應(yīng)混合物置于PCR儀中。PCR參數(shù)94°C 5分鐘；95°C 30秒，退火30秒，72°C 1分鐘，1個(gè)循環(huán)。圖3以GAPDH基因?yàn)槔疽镅由旖Y(jié)果。圖3A為不同退火溫度的條件下GAPDH基因的延伸結(jié)果，可以看出以為退火溫度時(shí)電泳條帶最清晰單一，因此確定作為GAPDH 基因延伸時(shí)的退火溫度(泳道4)。由于羧基修飾的磁性納米顆粒表面連接有5 ’端經(jīng)氨基修飾的特異性探針、通過堿基互補(bǔ)配對即能夠?qū)⒀由飚a(chǎn)物捕獲至磁性納米顆粒表面，從而將其與模板分離開來。因此在上述經(jīng)過延伸反應(yīng)后的體系中加入步驟1)中制備得到之羧基修飾的!^3O4OSiO2磁性納米顆粒100 μ g，加入雜交緩沖溶液100 μ L，室溫雜交1小時(shí)，磁分離，棄上清，以清洗緩沖液將顆粒洗滌三次，磁分離，即得到連有目標(biāo)核酸片段的磁性納米顆粒；加入洗脫緩沖液于 95°C水浴10分鐘，保留洗脫液。以洗脫液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。圖:3B示以人工合成的 GAPDH基因片段為模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)、再以磁性納米顆粒捕獲延伸產(chǎn)物的結(jié)果泳道 1為引物對照，泳道6為模板對照，兩者均無明顯條帶；泳道2-4為過程中所使用之洗脫緩沖液的電泳結(jié)果，亦無明顯條帶；泳道5為產(chǎn)物，電泳條帶單一且明顯，說明經(jīng)過引物延伸反應(yīng)后得到了 GAPDH基因的目標(biāo)片段，而連接有特異性探針的磁性納米顆粒能夠通過堿基互補(bǔ)配對將延伸產(chǎn)物捕獲至顆粒表面，從而將延伸得到的核酸片段與DNA模板片段分離開來，再經(jīng)過磁分離，即通過引物延伸與磁分離結(jié)合的方法獲取了 DNA模板中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息。GSTTl與GSTMl基因同樣得到了類似結(jié)果(為免重復(fù)，電泳圖未列出)。
實(shí)施例2以基因組DNA為模板進(jìn)行核酸序列拷貝數(shù)信息的獲取 1)磁性顆粒制備。如實(shí)施例1所述制備磁性顆粒待用。2)引物與探針設(shè)計(jì)。使用實(shí)施例1所述的GAPDH、GSTT1與GSTMl的引物與探針。3)產(chǎn)物捕獲方式獲取人類基因組DNA模板中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息。加入 5 μ L基因組DNA模板，98°C變性，加入雜交緩沖液與引物，雜交，使引物與基因組DNA模板充分結(jié)合。再如實(shí)施例1所述之反應(yīng)體系與具體實(shí)驗(yàn)步驟而獲取基因組DNA模板中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息。結(jié)果如圖4所示。泳道2為人類基因組DNA模板對照，泳道3為引物對照。泳道1為引物延伸產(chǎn)物的電泳結(jié)果，電泳條帶單一且明顯，說明以人類基因組DNA 為模板、經(jīng)過引物延伸反應(yīng)后得到了 GAPDH基因的目標(biāo)片段，而連接有特異性探針的磁性納米顆粒能夠通過堿基互補(bǔ)配對將延伸產(chǎn)物捕獲至顆粒表面，經(jīng)過磁分離后即獲取了基因組DNA模板中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息。GSTTl與GSTMl基因同樣得到了類似結(jié)果。_
實(shí)施例3對GAPDH、GSTTl和GSTMl進(jìn)行延伸產(chǎn)物的化學(xué)發(fā)光檢測實(shí)施例1與實(shí)施例2證實(shí)以人工合成的DNA為模板或以基因組DNA為模板通過引物延伸反應(yīng)都能夠得到目的核酸片段，可以進(jìn)行以下的檢測工作。1)磁性顆粒制備。如實(shí)施例1所述制備磁性顆粒待用。
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2)引物與探針設(shè)計(jì)。使用實(shí)施例1所述的GAPDH、GSTT1與GSTMl的引物與探針。3)生物素標(biāo)記的核酸片段的延伸形成。具體實(shí)驗(yàn)過程如下加入IOXBuffer 2 μ L^Mg2+ (25 mM) 2μ L.dNTP (2. 5 mM) 1.5 μ L(其中 Biotin-dUTP/dTTP :4/21 )、引物2· 5 μ L，人工合成的DNA模板2. 5 yL、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補(bǔ)足體積至20 μ Ldf 反應(yīng)混合物置于PCR儀中。PCR參數(shù)94°C 5分鐘；95°C 30秒，退火30秒，72°C 1分鐘，1 個(gè)循環(huán)。4)化學(xué)發(fā)光檢測。取連接有特異性探針的羧基修飾的磁性納米顆粒(10 mg/mL) 磁分離后吸去上清，在反應(yīng)體系中分別加入雜交液和步驟1)得到的延伸產(chǎn)物，以雙蒸水補(bǔ)足體積，混勻后以95 °C變性10分鐘，以退火溫度雜交1小時(shí)，每20分鐘混勻一次。經(jīng)洗滌緩沖液振蕩、清洗，最后磁分離吸去上清。加入封閉緩沖液混勻后室溫放置30分鐘，期間不斷混勻。磁分離后吸去上清，加入1:1000以封閉液稀釋的鏈親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(alkalin印h0Sphatase，ALP)溶液，混勻后室溫孵育30分鐘。磁分離后以洗滌緩沖液清洗。加入化學(xué)發(fā)光底物3-(2’ -螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3”_羥基)苯-1，2-二氧雜環(huán)丁舞酸(3_(2，-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3“ -phosphoryloxy) phenyl-1, 2-dioxetane, AMPPD)。充分混勻后，測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值至其穩(wěn)定。結(jié)果如圖5所示。測得的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值至70分鐘時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，GAPDH、GSTT1和 GSTMl基因延伸產(chǎn)物與空白對照的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度均值差值分別為871、10觀、1256，目標(biāo)基因與內(nèi)參基因化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度均值差值的比值分別為1. 18 (GSTT1/GAPDH)和1.44 (GSTM1/ GAPDH)。重復(fù)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果穩(wěn)定，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度均值差值及其比值無顯著的批間差異，說明經(jīng)過引物延伸反應(yīng)能獲得待測模板中目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息、再經(jīng)磁性介質(zhì)分離后檢測延伸產(chǎn)物的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值即能檢測模板中目標(biāo)與內(nèi)參核酸片段的含量，通過二者的比值即可計(jì)算得到待測模板與對照模板中目標(biāo)核酸片段相對于內(nèi)參核酸片段的變化，即檢測得到了目標(biāo)核酸片段在待測模板中的拷貝數(shù)變化情況。
權(quán)利要求
1.基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法，其特征在于1)制備適合于獲取核酸序列拷貝數(shù)信息的磁性介質(zhì)；2)設(shè)計(jì)能與目標(biāo)核酸序列特異性結(jié)合的引物與探針，探針5’端的修飾對應(yīng)1)所述磁性介質(zhì)上所修飾之功能化基團(tuán)，之后以產(chǎn)物捕獲方式獲取目標(biāo)核酸片段的拷貝數(shù)信息，產(chǎn)物捕獲方式指先進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，再利用磁性介質(zhì)表面連接的特異性探針與延伸反應(yīng)產(chǎn)物之間的堿基互補(bǔ)配對捕獲延伸得到的核酸片段；3)根據(jù)引物設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)確定Tm值，根據(jù)Tm值確定退火溫度，加入雜交緩沖溶液，經(jīng)過變性與退火過程，使引物與變性成單鏈的DNA模板充分結(jié)合；4)加入延伸反應(yīng)緩沖溶液， 進(jìn)行一個(gè)循環(huán)后結(jié)束反應(yīng)，再加入已制備的連接有特異性探針的磁性介質(zhì)與延伸產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而捕獲目標(biāo)核酸片段至磁性介質(zhì)；5)磁分離，對磁性介質(zhì)進(jìn)行清洗，即得到獲取了待測模板中目標(biāo)核酸片段拷貝數(shù)信息的磁性介質(zhì)；6)對反映至磁性介質(zhì)上的模板中的目標(biāo)基因與內(nèi)參基因核酸片段進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，比較目標(biāo)基因/內(nèi)參基因核酸片段化學(xué)發(fā)光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標(biāo)基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數(shù)變化信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法， 其特征在于所述磁性介質(zhì)為體現(xiàn)磁學(xué)性質(zhì)的物體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法， 其特征在于所述體現(xiàn)磁學(xué)性質(zhì)的物體為具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)構(gòu)成的物體或以具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)為部件的物體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法， 其特征在于所述延伸反應(yīng)體系為常規(guī)使用的PCR緩沖體系，所使用的酶為普通的Taq DNA 聚合酶、Vent" DNA聚合酶或De印Vent_ DNA聚合酶。
5.一種基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法，其特征在于制備步驟為a.磁性顆粒制備，采用溶劑熱法制備直徑在300 nm的四氧化三鐵磁性顆粒稱取1.35 g的FeCl3 · 6H20、3. 6 g的醋酸鈉以及1. 0 g聚乙二醇溶解于40 mL乙二醇中，磁力攪拌溶解，形成黃褐色膠體；將膠體轉(zhuǎn)移至四氟乙烯反應(yīng)釜，密封，置于200°C烘箱中反應(yīng)8小時(shí)； 反應(yīng)完成后以乙醇與去離子水清洗，烘干后得狗304磁性顆粒；用IOOmL 0. Imol鹽酸浸泡狗304磁性顆粒1小時(shí)，超聲分散30分鐘；再重新分散于體積濃度80%的乙醇中，以25°C、280 轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢瑁瑫r(shí)加入200 μ L正硅酸乙酯，反應(yīng)1小時(shí)；以乙醇、去離子水交叉洗滌；將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨，超聲30分鐘，在25°C、 300轉(zhuǎn)/分條件下攪拌，同時(shí)加入1 mL正硅酸乙酯，反應(yīng)3小時(shí)后，以乙醇、去離子水交叉洗滌數(shù)次，最后以乙醇分散，于4°C保存；制備得到核-殼結(jié)構(gòu)的!^3O4OSiA復(fù)合顆粒；磁性納米顆粒的氨基化，將上述制得的!^3O4OSiO2復(fù)合納米磁性顆粒磁分離，加入至乙醇/水混合溶液中并超聲分散，然后將10 μ L APTS滴加到以上混合溶液中，并在室溫下振蕩攪拌7 小時(shí)，利用外加磁場將APTS修飾的磁性顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，用乙醇溶液對其清洗 5次，磁分離，再用二甲基甲酰胺清洗5次，最后以5 mg/mL的濃度分散于DMF中，待用；氨基化磁性納米顆粒的羧基化，取分散于DMF溶液中的氨基化Si02/Fe304磁性納米顆粒，濃度為5 mg/mL,逐滴加入到等體積丁二酸酐濃度為0. OOlM的DMF溶液中，室溫下反應(yīng)M小時(shí)， 用水洗滌數(shù)次后磁分離，加入雙蒸水定容至10 mg/mL ；即得到功能性的羧基化磁珠；將上述羧基化磁珠用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水合物溶液反復(fù)清洗，磁分離，加入100 μ M以 MES溶液稀釋的氨基化探針至清洗過的磁珠中，混合均勻后室溫下旋轉(zhuǎn)孵育30分鐘，立刻加入冷的以MES溶液溶解的1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺至磁珠中混合均勻， 再以MES溶液補(bǔ)足體積至50 μ L，在4°C條件下旋轉(zhuǎn)孵育2小時(shí)，每20分鐘搖勻一次，磁分離后吸去上清，將磁珠于50 mM,pH 7.4 Tris溶液中孵育15分鐘以中和沒有反應(yīng)的活化的羧基基團(tuán)，再以50 mM，含0. 1 %wt Tween-20的Tris清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液封閉磁珠；即得到了連接有特異性探針的功能化磁珠；b.設(shè)計(jì)一對能與GAPDH、GSTTl與GSTMl基因特異性結(jié)合的引物與探針，探針5’端以氨基修飾，通過氨基-羧基相互反應(yīng)將探針固定至磁性顆粒表面；c.延伸加入IOXBuffer 2 μ L、25 mM Mg2+ 2μ L,2. 5 mM dNTP 1.5 μ L、上下游引物各2. 5 μ L，DNA模板2. 5 μ L、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補(bǔ)足體積至20 yL，將反應(yīng)混合物置于PCR儀中；PCR參數(shù)94°C 5分鐘；95°C 30秒，54°C 30秒，72°C 1分鐘，1個(gè)循環(huán)；將得到的雙鏈延伸產(chǎn)物進(jìn)行變性，通過堿基互補(bǔ)配對原則將變性后的單鏈延伸產(chǎn)物與連有特異性探針的磁性顆粒雜交，然后將連有單鏈DNA的磁性顆粒磁分離，進(jìn)行清洗；從而得到反映了目標(biāo)基因拷貝數(shù)信息的磁性介質(zhì)；d.對反映至磁性介質(zhì)上的模板中的目標(biāo)基因與內(nèi)參基因核酸片段進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測， 比較目標(biāo)基因/內(nèi)參基因核酸片段化學(xué)發(fā)光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標(biāo)基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數(shù)變化信息。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法，其特征在于所述磁性顆粒表面包被一層二氧化硅外殼。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法，其特征在于所述引物序列如下GAPDH GGAAGATGGTGATGGGATTT ；GSTTl GTCCCAGTTACCTCTCCGTCA ；GSTMl TCACTGGGGACACTCACAAA ；探針序列如下GAPDH: TCAAGGCTGAGAACGGGAAG ；GSTTl :AGCCTTGAAGGACGGGGACT ；GSTMl :TGGGCATGATCTGCTACAAT。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法，其特征在于所述包被方法為用100 mL 0. Imol鹽酸浸泡!^e3O4顆粒1小時(shí)，超聲分散 30分鐘；再重新分散于乙醇體積濃度80%的乙醇-水混合液中，以25°C、280轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢瑁?同時(shí)加入200 μ L SiO2的正硅酸乙酯，反應(yīng)1小時(shí)，以乙醇、去離子水交叉洗滌數(shù)次；將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨，超聲30分鐘，在 25°C、300轉(zhuǎn)/分條件下攪拌，同時(shí)加入1 mL正硅酸乙酯，反應(yīng)3小時(shí)后，以乙醇、去離子水交叉洗滌數(shù)次，最后以乙醇分散，于4°C保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法，其特征在于所述化學(xué)發(fā)光檢測為進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)過程中檢測得到的光信號，所使用的化學(xué)發(fā)光體系包括魯米諾、光澤精、過氧化草酸酯、1，2_ 二氧雜環(huán)丁烷類、吖啶酯或三(2， 2’ -聯(lián)吡啶)釕(III )。
全文摘要
基于磁分離與引物延伸的化學(xué)發(fā)光檢測拷貝數(shù)多態(tài)性的方法，制備適合于獲取核酸序列拷貝數(shù)信息的磁性介質(zhì)；設(shè)計(jì)能與目標(biāo)核酸序列特異性結(jié)合的引物與探針；根據(jù)引物設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)確定Tm值，使引物與變性成單鏈的DNA模板充分結(jié)合；加入延伸反應(yīng)緩沖溶液，捕獲目標(biāo)核酸片段至磁性介質(zhì)；磁分離；對反映至磁性介質(zhì)上的模板中的目標(biāo)基因與內(nèi)參基因核酸片段進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，比較目標(biāo)基因/內(nèi)參基因核酸片段化學(xué)發(fā)光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標(biāo)基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數(shù)變化信息。
文檔編號C12Q1/68GK102358910SQ20111034379
公開日2012年2月22日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者何農(nóng)躍, 曾新, 柳明 申請人:東南大學(xué)