專利名稱：用于檢測小鼠漢坦病毒的引物、探針及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，特別是涉及一種用于檢測小鼠漢坦病毒的實時熒光 PCR引物、探針及其試劑盒。
背景技術：
自然感染實驗動物的病毒很多，根據對人類的危害性，可將其分為三類；一類為人獸共患病病毒，能夠感染人與靈長類動物；二類目前尚無跡象表明感染人，但能在體外培養的人、猿和猴源性細胞中進行復制，對人類有潛在危險性；三類病毒在自然條件下僅感染動物本身，目前尚無跡象表明能夠感染人，因此對人類威脅不大。現今，小鼠作為單克隆抗體、蛋白類藥物等生物制品的一個主要來源，具有潛在的病毒污染。在《中華人民共和國藥典(2010年版)》三部中，規定了鼠源性生物制品需質檢的 8種鼠源病毒，其中鼠源RNA病毒有6種，分別為小鼠肺炎病毒(Pneumonia Virus of Mice, PVM)、漢坦病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(Lymphocytic Choriomeningitis Virus, LCMV)、呼腸孤病毒III型(Reovirus 3，Reo3)、仙臺病毒(Sendai virus，SEV)、小鼠白血病病毒(Murine leukemia virus，簡稱MuLV或MLV)，這些病毒屬于一類或二類，為人畜共患病毒或對人類有潛在危險性。鼠源性病毒檢測標準的制定對客觀評價生物制品質量，確保人民健康必將起到積極的作用。其中，漢坦病毒歸屬布尼亞病毒科，是一種有包膜分節段的負鏈RNA病毒，基因級為單負鏈RNA，分3個節斷，由核衣殼包繞，有包膜。病毒增殖時，以負鏈RNA為模板產生正鏈RNA和mRNA，由正鏈RNA復制子代病毒基因級，出芽釋放獲得包膜。基因組包括L、M、S3 個片段，分別編碼L聚合酶蛋白、Gl和G2糖蛋白、核蛋白。漢坦病毒包括引起腎綜合征出血熱(HFRS)的漢灘病毒(Hantaan virus，HTNV)、漢城病毒(Seoul virus，SE0V)、普馬拉病毒(Puumala virus, PUUV)、多不拉伐病毒(Dobrava virus, D0BV)及引起漢坦病毒肺綜合征(HPS)的無名病毒(Sin Nombre virus, SNV)、紐約病毒(New York virus, NYV)等。在國內常見的是腎綜合征出血熱(HFRS)，引起腎綜合征出血熱的漢坦病毒包括漢坦病毒(HTNV)，漢城病毒(SEOV)和普馬拉病毒(PUUV)，分別引起重度，中度和輕度的臨床癥狀。腎綜合征出血熱具有明顯的地區性和季節性，以10 12月份為多見，與鼠類的分布與活動有關。攜帶病毒的鼠(如黑線姬鼠)，通過唾液、尿、糞污染環境。人經呼吸道、消化道或直接接觸等方式被傳染。病毒導致全身毛細血管內皮細胞和小血管損傷，引起高熱、出血、腎臟損害和免疫功能紊亂等臨床表現。藥典規定的鼠源病毒檢測方法有細胞試驗、動物抗體產生實驗和雞胚感染實驗。 這些方法從生物效應角度來檢測鼠源病毒的潛在污染，檢測手段復雜費時，周期長，且對操作的實驗室有一定要求，不宜作為一種常規的指導生產的質控手段。而目前發展十分成熟的實時熒光PCR技術(Real-time Fluorence Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR)檢測靈敏度高，簡單方便，且對實驗室要求也很低。 Real Time PCR于1996年由美國Applied biosystems公司推出，是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，最后通過 Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(or cDNA)的起始濃度進行定性定量分析的方法。該方法自產生以來，不斷發展完善，特別是隨著Taqman熒光探針的廣泛應用，到目前為止該技術已經非常成熟。Taqman熒光探針的PCR檢測是指進行PCR擴增時，在反應體系中加入一對引物的同時還加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基因和一個淬滅熒光基團。當探針完整時，報告基因所發射的熒光信號被淬滅基因吸收，擴增時隨著Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其5’_3’外切核酸酶活性將探針酶切降解，報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，從而熒光檢測系統可以監測到熒光信號，模板每復制一次，就有一個探針被切斷伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一關系，所以信號累積與PCR產物完全同步。整個反應結束后，便可得到一條擴增曲線，由已知濃度標準樣品的擴增曲線可以得到一條標準曲線，根據該標準曲線以及樣品中的擴增曲線可對樣品進行定性定量分析。實時熒光PCR技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定性或定量，而且具有靈敏度和特異性高、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該已被廣泛用于免疫分析、細菌、病毒檢測等多個領域。經基因序列比較得知，HTNV、SE0V、D0BV間的Ns基因同源率較低，使用實時熒光PCR技術分別對HTNV、SEOV, DOBV進行檢測或對這3種病毒同時進行檢測方面還未見有報道。
發明內容
為了解決現有小鼠漢坦病毒檢測方法的不足，本發明提供了一種實時熒光PCR檢測小鼠漢坦病毒的引物、探針、試劑盒及其方法，使用含所述引物、探針的試劑盒檢測簡單方便、靈敏度高且檢測時間短。尤其在進行聯合檢測時，大大節省了時間，更經濟省力。本發明的一個目的是提供一種用于檢測小鼠漢坦病毒的實時熒光PCR引物，其中，所述引物選自特異性地擴增漢灘病毒、漢城病毒和普馬拉病毒的專用引物中的至少一對，其中，特異性地擴增漢灘病毒的專用引物是由具有序列表中的SEQ ID NO :1的上游引物與具有序列表中的SEQ ID NO 2的下游引物組成的一對寡核苷酸；特異性地擴增漢城病毒的專用引物是由具有序列表中的SEQ ID NO :3的上游引物與具有序列表中的SEQ ID NO 4的下游引物組成的一對寡核苷酸；特異性地擴增普馬拉病毒的專用引物是由具有序列表中的SEQ ID NO 5的上游引物與具有序列表中的SEQ ID NO :6的下游引物組成的一對寡核苷酸。本發明的另一個目的是提供一種可與上述提及引物配合使用的探針，其中，所述探針選自特異性地擴增漢灘病毒、漢城病毒和普馬拉病毒的專用探針中的至少一種，其中，特異性地擴增漢灘病毒的專用探針具有序列表中的SEQ ID NO 7核苷酸序列；特異性地擴增漢城病毒的專用探針具有序列表中的SEQ ID NO 8核苷酸序列；特異性地擴增普馬拉病毒的專用探針具有序列表中的SEQ ID NO 9核苷酸序列。優選地，所述探針5’端連接有熒光報告基團，3’端連接有熒光淬滅基團。
優選地，所述熒光報告基團選自FAM、VIC、JOE、HEX中的任意一種，所述熒光淬滅基團選自TAMRA或Eclipse。優選地，所述熒光報告基團為FAM，所述熒光淬滅基團為TAMRA。本發明的又一個目的是提供一種用于檢測小鼠漢坦病毒的實時熒光PCR試劑盒， 其中，所述試劑盒包括上述提及的引物、探針。優選地，所述試劑盒還包括RT-PCR擴增試劑、陽性RNA標準品、酵母tRNA稀釋液、 陰性質控品、空白對照。優選地，所述RT-PCR擴增試劑為 2 X Taqman PCR Mix,40 X TaqmanRT-Enzyme MIX。優選地，所述陽性RNA標準品通過下述方法獲得擴增含序列表中SEQ ID NO 10 所示的堿基序列的PMD18-T載體，得到445bp的DNA片段，體外轉錄所述DNA片段并純化獲得的RNA即標準品。本發明的再一個目的是提供一種檢測小鼠漢坦病毒的實時熒光PCR方法，其中， 所述方法包括使用上述提及的引物及提及的任一所述的探針進行的實時熒光PCR檢測。優選地，所述實時熒光PCR的反應體系還包括RT-PCR擴增試劑、陽性RNA標準品、 酵母tRNA稀釋液、陰性質控品、空白對照。優選地，所述實時熒光PCR的反應條件為48°C，15min ；95°C，IOmin ；95°C，15sec， 60°C，40sec，共 40 個循環。優選地，所述方法還包括標準曲線的建立，方法為擴增含序列表中SEQ ID NO 10 所示的堿基同源序列的PMD18-T載體，得到445bp的DNA片段，體外轉錄所述DNA片段并純化獲得的RNA作為陽性RNA標準品，將其十倍稀釋成不同濃度的陽性定量標準品，以所述陽性定量標準品作為模板進行實時熒光PCR檢測，得到檢測小鼠漢坦病毒的標準曲線。本發明的最后一個目的是提供一種上述提及的引物、探針在檢測鼠源生物制品中小鼠漢坦病毒殘留時的應用。與現有檢測方法相比，本發明提供的實時熒光PCR試劑盒或方法檢測小鼠漢坦病毒具有以下優點1、簡單快速現有的藥典小鼠漢坦病毒檢測方法為細胞試驗、動物抗體產生實驗和雞胚感染實驗，從生物學效應角度檢測生物制品中小鼠漢坦病毒的潛在感染，需時長 (1 4周時間)，而本發明從核酸角度對小鼠漢坦病毒進行檢測，從樣品RNA提取開始到獲得結果只需要6小時左右，其中本發明熒光定量PCR使用的是一步法反應體系，操作更為簡便快速，只需1小時45分鐘的時間。并且，本發明對操作實驗室環境要求不高，規避了以前抽檢產品可能產生的漏洞，可在企業實現批批檢測，進一步提高了生物制品質控質量；另一方面，本發明也可對兩種或兩種以上的小鼠漢坦病毒進行聯合檢測，從而進一步節省了時間和成本，更加經濟方便；2、靈敏度高現有檢測方法是從生物學效應角度檢測生物制品中小鼠漢坦病毒的潛在感染，其中因制劑在制備過程中經過了多個工藝步驟的處理，殘留鼠源病毒的活病毒抗原及病毒抗體存在的可能性極小，而本發明從病毒核酸角度進行檢測，相對前述藥典規定方法而言，提高了檢測的靈敏度。利用本發明中的實時熒光PCR試劑盒或方法無論是單獨還是聯合檢測鼠源生物制品中小鼠漢坦病毒時，可以定性也可以準確定量，目標RNA在 IO2 IO7濃度范圍內，都有很好的線性關系，靈敏度高均可達到20cOpieS/ μ 1 (lOOcopies/
6reaction)；3、重復性、準確性和特異性本發明中的引物和探針分別根據每種小鼠漢坦病毒的基因序列設計，設計時充分考慮各引物間的退火溫度，是經篩選后得到的特異性引物和探針，且與小鼠基因組無同源性，檢測特異性強，重復性好；4、準確性更高本發明使用的是RNA標準品，更貼近病毒的天然狀態；同時，在進行檢測時標準品和樣品都是RNA，在提取和擴增體系上具有一致性；5、回收率高本發明從提取步驟開始(而不只是熒光定量PCR過程)衡量了整個方法的可行性。行業內通用標準要求檢測方法的回收率要達到50%以上，本發明實時熒光定量PCR方法回收率均達到了 80%以上，是一種理想的可替代現有藥典規定的檢測方法。
圖1為漢灘病毒實時熒光定量PCR定量曲線；圖2為漢城病毒實時熒光定量PCR定量曲線；圖3為普馬拉病毒實時熒光定量PCR定量曲線；圖4為漢灘病毒實時熒光定量PCR標準曲線；圖5為漢城病毒實時熒光定量PCR標準曲線；圖6為普馬拉病毒實時熒光定量PCR標準曲線。
具體實施例方式以下所舉實施例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的保護范圍。下述實施例中所述試劑原料除特別注明來源外，均為市售的常見原料，試劑的配制采用常規方法。實施例中未詳述的方法均為本領域常規操作，詳見《分子克隆》第三版。實施例1小鼠漢坦病毒實時熒光PCR檢測專用引物和探針的設計從genbank中查到已有的三種漢坦病毒漢灘病毒、漢城病毒及普馬拉病毒的基因組序列，分別對三種病毒的序列比對找出的保守的同源序列區域，設計實時熒光PCR檢測專用引物和探針序列。其中各病毒優選的引物、探針序列如下表1所示表 權利要求
1.用于檢測小鼠漢坦病毒的實時熒光PCR引物，其特征在于，所述引物選自特異性地擴增漢灘病毒、漢城病毒和普馬拉病毒的專用引物中的至少一對，其中，特異性地擴增漢灘病毒的專用引物是由具有序列表中的SEQ IDNO=I的上游引物與具有序列表中的SEQ ID NO 2的下游引物組成的一對寡核苷酸；特異性地擴增漢城病毒的專用引物是由具有序列表中的SEQ IDNO 3的上游引物與具有序列表中的SEQ ID NO 4的下游引物組成的一對寡核苷酸；特異性地擴增普馬拉病毒的專用引物是由具有序列表中的SEQ IDNO 5的上游引物與具有序列表中的SEQ ID NO :6的下游引物組成的一對寡核苷酸。
2.與權利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于，所述探針選自特異性地擴增漢灘病毒、漢城病毒和普馬拉病毒的專用探針中的至少一種，其中，特異性地擴增漢灘病毒的專用探針具有序列表中的SEQ ID NO 7核苷酸序列；特異性地擴增漢城病毒的專用探針具有序列表中的SEQ ID NO 8核苷酸序列；特異性地擴增普馬拉病毒的專用探針具有序列表中的SEQ ID NO :9核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的探針，其特征在于，所述探針5’端連接有熒光報告基團，3’ 端連接有熒光淬滅基團。
4.根據權利要求2或3所述的探針，其特征在于，所述熒光報告基團選自FAM、VIC、 JOE、HEX中的任意一種，所述熒光淬滅基團選自TAMRA或Eclipse。
5.根據權利要求2 4任一所述的探針，其特征在于，所述熒光報告基團為FAM，所述熒光淬滅基團為TAMRA。
6.一種用于檢測小鼠漢坦病毒的實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1中所述的引物及權利要求2 5任一所述的探針。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括RT-PCR擴增試劑、陽性RNA標準品、酵母tRNA稀釋液、陰性質控品、空白對照。
8.根據權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR擴增試劑為2X Taqman PCR Mix、40XTaqman RT-Enzyme MIX。
9.根據權利要求6 8任一所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性RNA標準品通過下述方法獲得擴增含序列表中SEQ ID NO 10所示的堿基序列的pMD18-T載體，得到44^p的 DNA片段，體外轉錄所述DNA片段并純化獲得的RNA即標準品。
10.一種檢測小鼠漢坦病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于，所述方法包括使用權利要求1中所述的引物及權利要求2 5任一所述的探針進行實時熒光PCR檢測。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述實時熒光PCR的反應體系還包括 RT-PCR擴增試劑、陽性RNA標準品、酵母tRNA稀釋液、陰性質控品、空白對照。
12.根據權利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述實時熒光PCR的反應條件為 48°C, 15min ；95°C, IOmin ；95°C，15sec，60°C，40sec，共 40 個循環。
13.根據權利要求10 12任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包括標準曲線的建立，方法為擴增含序列表中SEQ ID N0:10所示的堿基同源序列的pMDIS-T載體，得到 445bp的DNA片段，體外轉錄所述DNA片段并純化獲得的RNA作為陽性RNA標準品，將其十倍稀釋成不同濃度的陽性定量標準品，以所述陽性定量標準品作為模板進行實時熒光PCR 檢測，得到檢測小鼠漢坦病毒的標準曲線。
14.權利要求1中所述的引物或權利要求2 5任一所述的探針在檢測鼠源生物制品中小鼠漢坦病毒殘留時的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測小鼠漢坦病毒的引物、探針及其方法。使用含所述引物、探針的試劑盒檢測小鼠漢坦病毒簡單方便、靈敏度高且檢測時間短。尤其在進行漢灘病毒、漢城病毒和普馬拉病毒三種漢坦病毒聯合檢測時，大大節省了時間，更經濟省力，解決了現有檢測手段復雜費時，周期長，且對操作的實驗室有一定要求的不足，具有很好的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102352416SQ201110340729
公開日2012年2月15日 申請日期2011年11月2日 優先權日2011年11月2日
發明者周志文, 李萃, 王剛, 蔣立新, 譚淑萍 申請人:舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司