專利名稱：一種二十碳五烯酸生產菌株的篩選方法
技術領域：
本發 明涉及微生物菌種篩選技術，特別涉及一種二十碳五烯酸生產菌株的篩選方法。
背景技術：
二十碳五烯酸(EPA)是ω -3系列多不飽和脂肪酸的一種，人體能通過植物中攝取的α-亞麻酸微量地轉化為ΕΡΑ，滿足一般健康需求。但是老年人、幼兒及糖尿病人則不能將α _亞麻酸有效地轉化為ΕΡΑ，這就必需從食物中直接攝取EPA。二十碳五烯酸又俗稱“血管清道夫”，能抑制血小板凝集，減少血栓素形成，具有預防心肌梗塞和腦梗塞作用，同時具有降血脂、防動脈硬化、抗癌及抗炎的作用。由于EPA對機體具有良好的生理功效，目前已在醫藥、食品、飼料、化工領域廣泛應用。國內外市場上，EPA的主要產品是以保健食品上市的含EPA和DHA魚油的明膠軟微膠囊，另外還有以醫藥品上市的甲酯膠囊和乙酯膠囊，EPA 含量可達60%以上。絕大多數的植物油中不含EPA，天然EPA的來源主要為海產魚類、貝類和一些海藻類，如海狗油、海豹油、金槍魚、沙丁魚、白蛤等。其加工原料主要采用海產魚油，由于魚油來源容易受季節、氣候等環境因素影響，且過多捕獵會破壞海洋生態平衡，所以無法滿足市場對EPA產量的要求，開發新來源成為目前學者關心的問題。微生物發酵法生產EPA不受自然條件影響，作為EPA原料來源明顯優于魚類等資源，是取代魚油原料的最佳選擇。目前已發現含有EPA的微生物種類有真菌、海水細菌、藻類等。真菌在自然界分布廣且易培養，所以從真菌中選育EPA高產菌株前景廣闊。含EPA真菌主要為多種低等菌，如被孢霉、腐霉、蟲霉、壺菌等。目前已在高山被孢霉(Mortierella alpina)，長孢被孢霉，樟疫霉(Phytophthora ciaoamrnni)，終極腐霉(Pythiumultimum)，輪梗霉(Diasporangium sp.)，腐霉(Pythium)，畸雌腐霉(Pythium irregulare)，刺腐霉(P. spinosumSawada)等真菌中發現含有EPA。其中，腐霉是一種絲狀真菌，菌體內的油脂中含有不飽和脂肪酸，尤其是 EPA含量較高，是生產EPA的良好菌種。目前含EPA菌種的篩選方法是從土壤中獲得大量菌株后，通過油脂提取和脂肪酸分析來確定生產菌株，其方法耗時長、工作量大。
發明內容
本發明的目的是提供一種二十碳五烯酸生產菌株的篩選方法，其方法步驟簡單、 周期短，能有效快速地獲得二十碳五烯酸高產菌株。本發明所提出的二十碳五烯酸生產菌株的篩選方法，具體步驟包括步驟一、誘導培養將采集的土樣置于無菌培養皿內，噴適量無菌水保持濕度，將經滅菌的誘物塊按每皿1 5塊均勻放置在培養皿內的土樣上，使誘物部分埋于土內，培養見誘物上有菌絲長出，將菌絲移植到含硫酸鏈霉素600單位/ml和青霉素鈉鹽1000單位/ ml的PDA培養基平板上25°C培養2天；所述土樣采集于菜園或果園5 15cm深處；所述的誘物塊為1公分大小的黃瓜、土豆、黃豆、花生和胡蘿卜塊的任一種或是幾種；步驟二、分離純化采用稀釋涂布法對培養菌體進行分離純化，直至得到純菌株， 將得到的菌株采用PDA培養基斜面保種，編號保存；步驟三、初步篩選將純化菌株從斜面中挑取菌絲于試管中，加入蘇丹II與蘇丹 IV混合液染色5分鐘，用水沖洗后取染色的菌絲置于載波片上顯微鏡觀察；選取脂肪粒大而多的菌株為初篩菌種并確定其編號；所述蘇丹II與蘇丹IV混合液的配制用30ml的丙酮與乙醇等體積混合液振蕩溶解Ig蘇丹II后，靜置24小時以上，取上清液或者過濾液；以同方法配制蘇丹IV染液，將蘇丹II染液與蘇丹IV染液等體積混合；步驟四、復篩將初篩菌種采用PDA固體培養基擴大培養，得到的孢子采用液體培養基再次擴大培養；收獲菌絲烘干后研磨，用石油醚提取油脂，經甲酯化后進行氣相色譜分析，選取EPA含量高的菌株確定編號，完成EPA高產菌株的篩選；所述液體培養基的組成為 葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，硝酸鈉3g/L，磷酸氫二鈉lg/L，硫酸鎂0. 5g/L。 采用本發明篩選到EPA含量較高的菌株，其中編號SW-43的菌株經菌落菌絲形態、 生理生化及ISSrDNA鑒定為華麗腐霉。本發明通過誘導方法獲得菌絲，先采用蘇丹染色法挑選脂肪含量高的菌株，再進行氣相色譜分析確定EPA高產菌株，快速有效地篩選到二十碳五烯酸產量高的真菌菌株，方法步驟簡單、篩選周期短，而且所篩選菌株的花生四烯酸含量低、繁殖快、易培養，適合于工業化生產，對擴大EPA的微生物來源及其商業化生產具有重要意義。
附圖1為采用本發明方法篩選得到的SW-43號菌株脂肪酸甲酯的氣相色譜圖， 橫坐標為保留時間(min)，縱坐標為電壓值(mv)，經與標準品對照，EPA甲酯的出峰時間為 17.90min，含量11. 13%。附圖2為SW-43號菌株脂肪酸甲酯質譜圖，橫坐標為質荷比(m/ ζ)，縱坐標為電壓值(mv)，經過NIST02版標準譜庫檢索，附圖1色譜圖中17. 90mi η峰的質譜圖與NIST中EPA甲酯質譜圖主要的碎片離子峰完全一致，因此確認該成分為EPA甲酯。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明技術方案進行詳細說明。其中，1. PDA培養基參見[周德慶，微生物學實驗教程(第二版)，高等教育出版社]，為 馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15 20g/L，水IOOOml ；2. PDA培養基中加入抗生素方法在培養基滅菌后冷卻至50°C 60°C時，將注射用硫酸鏈霉素和青霉素鈉鹽溶解后加入到培養基中，攪拌均勻后倒成平皿培養基；使培養基中硫酸鏈霉素600單位/ml、青霉素鈉鹽1000單位/ml ；3.蘇丹II與蘇丹IV混合液的配制和液體培養基組成與前述方法相同。4.篩選出菌株的編號為SW-XX，其中SW意為陜西省微生物研究所。實例1、( 土樣采集于湖北武漢花山鎮絲瓜菜地5 15cm深處)步驟一、誘導培養、分離純化將采集的土樣分成10份，每份均攤在無菌平皿中， 噴適量無菌水至土樣濕潤；另將約1公分大小的誘物塊(土豆塊)煮熟；涼后按每皿5塊均勻放置在培養皿內的土樣上，使誘物部分埋于土內，培養見誘物上有菌絲長出，立即將菌絲移植到含抗生素的PDA培養基平板上25°C培養2天；采用稀釋涂布法對長出的菌株進行分離純化，直至獲得純菌株；將得到的菌株采用PDA培養基斜面保種，并編號保存；步驟二、初步篩選按編號從PDA斜面中挑取菌絲于試管中，加入蘇丹II與蘇丹 IV混合液染色5分鐘，用水沖洗3次，挑少量菌絲置于載波片，用400倍顯微鏡觀察菌絲，選取脂肪粒大而多的菌株(菌絲體內脂肪粒被染成紅色)為初篩菌種并確定其編號(對初篩出菌種可以重新編號，并斜面保種)；
步驟三、復篩將初篩菌種接種至PDA培養基斜面上，擴大培養3 5天后，用IOml 無菌水洗脫斜面上孢子，用接種鉤打散后把含孢子的水溶液倒入液體培養基中，于25°C、 180轉/分鐘條件下培養5天；收獲菌絲，抽濾后，蒸餾水洗3遍，80°C烘干至恒重；用研缽把菌絲研成粉末，稱取Ig菌粉置于離心管，用3ml石油醚(30 60沸程)抽提2次，蒸干溶齊U，測定油脂含量。取油脂0. 05g置于具塞試管中，加入0. 5mol/L的KOH甲醇溶液lmL，60°C 水浴中皂化15min，冷卻后加入14%三氟化硼乙醚甲醇溶液2ml，于60°C水浴中振蕩2min， 冷卻后加入正己烷Iml振蕩，再加入飽和氯化鈉溶液1ml，靜置后取上清液進行氣相色譜分析(脂肪酸甲酯)；爐溫升溫程序為180°C 200°C，5°C /min ；再200°C 220°C，1°C /min ； 至220°C保持6min ；進樣器和檢測器240°C；用標準二十碳脂肪酸甲酯為標準品確定二十碳五烯酸含量；選取EPA含量高的菌株確定編號，完成EPA生產菌株的篩選。篩選出EPA含量高于5%的菌株有SW-2的EPA含量5. 98% ；Sff-5的EPA含量
6.51% ； SW-8 的 EPA 含量 8. 34% ； Sff-16 的 EPA 含量 6. 38% ； Sff-20 的 EPA 含量 7.99%。實例2、( 土樣采集于陜西銅川市耀州區南街村農家葡萄園5 15cm深處)按實例1的方法步驟操作；其中，將土樣分成20份均攤在無菌平皿中，所用的誘物塊為黃瓜、土豆和黃豆，按每皿3塊均勻放置在培養皿內，其他操作均與實例1的方法步驟相同。篩選出EPA含量高于5%的菌株有SW-21的EPA含量8. 75% ；Sff-28的EPA含量
7.33% ；SW-33 的 EPA 含量 8. 12% ；Sff-35 的 EPA 含量 9. 79%。實例3、(土樣采集于陜西藍田縣華胥鎮白菜地5 15cm深處)按實例1的方法步驟操作；其中，將土樣分成20份均攤在無菌平皿中，所用的誘物塊為黃瓜、土豆、黃豆、花生和胡蘿卜按每皿3塊均勻放置在培養皿內，其他操作均與實例1 的方法步驟相同。篩選出EPA含量高于5%的菌株有SW-41的EPA含量10. 04%;Sff-43的EPA含量 11. 13% ；SW-44 的 EPA 含量 9. 17% ；Sff-45 的 EPA 含量 6. 78% ；Sff-47 的 EPA 含量 7. 82% ； SW-48 的 EPA 含量 7. 36%。其中SW-43號菌株的EPA含量最高，為11. 13%。對SW-43號菌株提取油脂進行氣相色譜_質譜分析，再次確認EPA含量，其結果見附圖1和附圖2。
權利要求
1.一種二十碳五烯酸生產菌株的篩選方法，其特征在于，具體包括步驟一、誘導培養將采集的土樣置于無菌培養皿內，噴適量無菌水保持濕度，將經滅菌的誘物塊按每皿1 5塊均勻放置在培養皿內的土樣上，使誘物部分埋于土內，培養見誘物上有菌絲長出，將菌絲移植到含硫酸鏈霉素600單位/ml和青霉素鈉鹽1000單位/ml的 PDA培養基平板上25°C培養2天；所述土樣采集于菜園或果園5 15cm深處；所述的誘物塊為1公分大小的黃瓜、土豆、黃豆、花生和胡蘿卜塊的任一種或是幾種；步驟二、分離純化采用稀釋涂布法對培養菌體進行分離純化，直至得到純菌株，將得到的菌株采用PDA培養基斜面保種，編號保存；步驟三、初步篩選將純化菌株從斜面中挑取菌絲于試管中，加入蘇丹II與蘇丹IV混合液染色5分鐘，用水沖洗后取染色的菌絲置于載波片上顯微鏡觀察；選取脂肪粒大而多的菌株為初篩菌種并確定其編號；步驟四、復篩將初篩菌種采用PDA固體培養基擴大培養，得到的孢子采用液體培養基再次擴大培養；收獲菌絲烘干后研磨，用石油醚提取油脂，經甲酯化后進行氣相色譜分析， 選取EPA含量高的菌株確定編號，完成EPA高產菌株的篩選。
2.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟四中所述液體培養基的組成為 葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，硝酸鈉3g/L，磷酸氫二鈉lg/L，硫酸鎂0. 5g/L。
全文摘要
一種二十碳五烯酸生產菌株的篩選方法，本發明是將采集的土樣用誘物塊誘導培養，將分離純化得到的純菌株經染色后初步篩選，再經擴大培養后提取油脂，進行氣相色譜分析，篩選得到EPA含量高的菌株。本發明能快速有效地篩選到二十碳五烯酸產量高的真菌菌株，方法步驟簡單、篩選周期短，而且所篩選菌株的花生四烯酸含量低、繁殖快、易培養，適合于工業化生產，對擴大二十碳五烯酸的微生物來源及其商業化生產具有重要意義。
文檔編號C12R1/645GK102358886SQ20111033298
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者盧美歡, 李利軍, 馬英輝 申請人:陜西省微生物研究所