專利名稱：提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉基因載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉基因載體。
背景技術：
豬肉作為中國人民的主要肉類食品，保證全國人民有充足的、優質的豬肉供應是關系到人民日常生活的重要事件。而隨著人口的增長和人民生活水平的提高，除了對豬肉的需求量增加以外，對豬肉的質量和口感的要求也提高了。上海浦東國際機場就曾發現從日本走私運入價值一百萬余元、八百多公斤的頂級和牛肉(又稱雪花牛肉)，由此可見中國對高檔肉類產品的消費需求。因此，有必要建立和改良中國自己的豬的品種，改善豬肉口感和質量，以滿足人民群眾的生活需求。
前面提到的頂級和牛肉的特點是肉色艷麗，脂肪有如大理石花紋般分布在肌肉內，可比秋季降霜時的美麗，而且由于肌肉中富含脂肪，入口柔融欲化，風味鮮美。因此，可通過降低豬全身的脂肪含量來提高瘦肉率，同時，增加肌肉中的脂肪含量來改善豬肉的口感和品質。在肌肉中過表達PEPCK-C的(PEPCK-Cmus)轉基因小鼠有著令人吃驚和興奮的表型。首先，PEPCK-Cmus轉基因小鼠的運動能力遠遠高于對照小鼠，可以以20米/分鐘的速度跑上5公里(對照小鼠在同樣的速度下只能跑0.2公里)。其次，PEPCK-Cmus轉基因小鼠的壽命遠遠長于對照小鼠，而且在30-35月時還能夠產下正常的小鼠后代(大多數小鼠在12-18月時就失去生殖能力了)。PEPCK-Cmus轉基因小鼠的高運動能力可能與骨骼肌里的甘油三酯的增加有關。盡管PEPCK-Cmus轉基因小鼠全身的脂肪含量下降，不到對照小鼠脂肪含量的一半，但是PEPCK-Cmus轉基因小鼠比對照小鼠卻有更多的脂肪分布于骨骼肌中(Hakimi, P.et al.“Overexpression of the cytosolic form of phosphoenolpyruvatecarboxykinase(GTP) in skeletal muscle repatterns energy metabolism in themouse.”J Biol Chem，2007.282 (45):32844-32855)。PEPCK-Cnius 轉基因小鼠中低脂肪含量和高肌間脂肪含量的特點和頂級和牛肉的特性是類似的。基于PEPCK-Cmus轉基因小鼠的神奇表型，我們預期在豬的骨骼肌中過表達PEPCK-C可降低豬的脂肪含量，并在肉質和口感上得到大幅度的提高，這樣的豬肉有著巨大的經濟價值。大規模的生產PEPCK-Cnus轉基因豬有望填補國內在高品質豬肉的空白，豐富人民群眾的菜籃子，對提高人民群眾的生活質量有重要的意義。而且PEPCK-C轉基因可提高小鼠的生殖能力，因此，PEPCK-Cmus轉基因豬很可能在繁殖能力上有所提高，在優良品種的繁殖上有著廣泛的應用前景。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種能提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉基因載體。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
轉基因載體含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase,MCK)增強子、2kb豬的α-骨骼肌肌動蛋白(a-skeletal actin)基因的啟動子、豬的PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因(bGH)的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因一嘌呤霉素(PuiOmycin)基因和原核細胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素(Zeocin)基因(見圖2)。2kb的α-骨骼肌肌動蛋白(a-skeletal actin)的啟動子可保證下游的基因在骨骼肌中特異表達，而且MCK增強子也具有肌肉組織特異性的增強子活性，可特異地促進下游基因的高表達。在此轉基因載體中表達的是豬自身的PEPCK-C基因，所以從食品安全的角度講，對消費者的健康沒有任何影響。此外，本發明在嘌呤霉素和博萊霉素抗性基因的兩端還加入LoxP序列，這樣，在PEPCK-C基因整合到基因組DNA后，如有需要，本發明可通過表達Cre蛋白，誘導LoxP序列的重組，以除去抗性基因，進一步保障轉基因動物的食品安全性。本發明構建的在肌肉組織特異表達豬PEPCK-C的轉基因載體PZT52的全序列如SEQ ID No:1所示，其中，第29-1897堿基為豬PEPCK-C編碼區，第2278-2491堿基為bGH3’端不翻譯區，第2267-2300堿基為LoxP，第3056-3727堿基為嘌呤霉素抗性基因，第3785-4156堿基為博萊霉素(Zeocin)抗性基因，第4166-4199堿基為LoxP，第5673-6023堿基為MCK增強子，第6119-8052堿基為豬α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子。本發明的轉基 因載體可應用于體細胞克隆，以構建高瘦肉率、高肌間脂肪含量和高生殖能力的PEPCK-Cmus轉基因豬。
圖1是本發明的技術流程圖。圖2是本發明構建的ΡΖΤ52轉基因載體的示意圖。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1:插入 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段,構建 pZTl。將pO)NA3.I (myc-His) a 載體(Invitrogen)用 PvuII 酶切，酶切體系為 2 μ g 質粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I PvuII 酶，加入 ddH20 補足體積至 30 μ 1，37°C溫浴 3 小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出3.3kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟為，將紫外光下切下目的DNA條帶裝入1.5ml離心管中，稱重后加入3倍體積的溶膠液，55°C保溫10分鐘，使瓊脂糖凝膠完全融化；融化的凝膠待溫度降至室溫后，將混合液轉入附柱中，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；加入650 μ I漂洗緩沖液，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；吸附柱再次離心，10，OOOg離心，I分鐘，倒掉流出液；將吸附柱轉移到一個新的1.5ml離心管中，加入50 μ I ddH20，放置I分鐘，10，OOOg離心I分鐘收集純化產物。從pSNAP載體用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段，酶切體系為3 μ g質粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I EcoRV 酶，加入 ddH20 補足體積至 30 μ 1，37°C溫浴 3 小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.7kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將PCDNA3.1 (myc-His) a (PvuII)和 LoxP-Puro-Zeo-LoxP (EcoRV)連接，連接反應中加入2μ I載體，6μ I插入片段，1μ I 10Xbuffer，I μ I T4DNA連接酶，16°C溫浴16小時。將連接產物轉化到E.coli的感受態細胞中。取一管50 μ I的Trans5 α感受態細胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4μ I上述連接產物，輕彈混勻，后于冰上孵育30分鐘；42°C熱擊30秒，后冰上靜置10分鐘；加入500 μ I無抗性的LB液體培養基，37°C震蕩培養I小時；4，OOOrpm離心5分鐘，吸走，保留100 μ I左右的培養基，用移液器將細菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨節和博萊雙抗性的LB培養基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養16小時。克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的兩條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT1。實施例2:插入豬α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，構建pZT20。將pZTl用PvuI和NdeI雙酶切，酶切體系為2yg質粒DNA，3y I 10Xbuffer,1.5μ I PvuI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出4.0kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過全基因合成(InvitiOgen)得到2kb長度的豬α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，用PvuI和NdeI雙酶切，酶切體系為3μ g質粒DNA，3y I 10 X buffer,1.5 μ IPvuI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出2kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZTl (PvuI/NdeI)和豬α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA(PvuI/NdeI)連接，連接反應同上。將連接產物轉化到Ε.coli的感受態細胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進行抗性篩選。克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到3.8kb和2.0kb的兩條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT20。實施例3:插入豬PEPCK-C編碼區域DNA片段，構建pZT43。將ρΖΤ20 用 NdeI 和 KpnI 雙酶切，酶切體系為 2μ g質粒 DNA，3y I 10Xbuffer,1.5μ I KpnI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30 μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電 泳分離，切出5.5kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過全基因合成(Invitrogen)得到豬PEPCK-C編碼區域DNA片段，用NdeI和KpnI雙酶切，酶切體系為 3μ g 質粒 DNA，3y I 10 X buffer,1.5 μ I PvuI 酶，L 5μ I NdeI 酶，力口入ddH20補足體積至30 μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出2.1kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZT20 (KpnI/NdeI)和豬 PEPCK-C 編碼區域 DNA 片段(KpnI/Ndel)連接，連接反應同上。將連接產物轉化到E.coli的感受態細胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進行抗性篩選。克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到3.3kb、2.1kb和2.0kb的三條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT43。實施例4:插入MCK增強子DNA片段，構建pZT52。將ρΖΤ43 用 PvuI 酶切，酶切體系為 2 μ g 質粒 DNA，3 μ I 10 X buffer,1.5 μ IKpnI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出7.5kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。pZT43 載體的去磷酸化，35 μ I pZT43 (PvuI), 4 μ I IOXbuffer, I μ I 牛小腸堿性去磷酸化酶(CIP)，37°C溫浴I小時。然后將反應體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出7.5kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過PCR擴增得到MCK增強子DNA片段，PCR條件如下:I μ I (約IOng)模板DNAPST181，引物 I (gataCGATCGACGGGCCAGATATACGCGTTAGAA)和引物 2 (ccggCGATCGGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTAT)的終濃度均為 0.5 μ M, dNTPs 的終濃度為 0.2mM, 5 μ I 10 X buffer, I μ IHiFi Taq酶，加入ddH20補足體積至50 μ I。PCR循環為，95°C，2分鐘；接著是95°C，30秒，550C，30秒，72 0C，30秒，35個循環；72°C，5分鐘；4°C，保溫。然后將PCR產物在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出500bp大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。用PvuI 酶切 MCK 增強子 DNA 片段，酶切體系為 3μ g DNA，4 μ I 10 X buffer, 3 μ IPvuI酶，加入ddH20補足體積至40μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出500bp大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZT43(PvuI/CIP)和MCK增強子DNA片段(PvuI)連接，連接反應同上。將連接產物轉化到E.coli的感受態細胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進行抗性篩選。克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用PvuI酶切鑒定，陽性克隆中可得到7.5kb和0.5kb的兩條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT52。
權利要求
1.一種提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉基因載體，其特征在于，該轉基因載體含有小鼠的肌酸激酶增強子、2kb豬的α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子、豬的PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因一嘌呤霉素基因和原·核細胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。
全文摘要
本發明公開了一種提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉基因載體，該轉基因載體含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase，MCK)增強子、2kb豬的α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子、豬的PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因--嘌呤霉素基因和原核細胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。本發明的轉基因載體可應用于體細胞克隆，以構建高瘦肉率、高肌間脂肪含量和高生殖能力的PEPCK-Cmus轉基因豬。
文檔編號C12N15/85GK103074372SQ201110329199
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者戴一凡, 陳凌懿 申請人:南開大學