專利名稱：基于功能化納米金電極的快速檢測菌落總數的方法
技術領域：
本發明屬于食品中微生物學檢驗的技術領域，具體涉及一種基于功能化納米金電極的快速檢測菌落總數的方法。
背景技術：
牛奶營養價值高，但易變質、易腐敗。在牛奶的生產、運輸、銷售過程中，還可能受到多種細菌的污染，其中含有很多潛在的有害微生物，這些微生物不僅破壞牛奶質量，而且可能危害飲用者身體健康。傳統的微生物檢測技術非常繁瑣，需要耗費大量的人力物力，而且檢測周期長，按國標GB/T4789. 2進行檢測，菌落總數的結果需要4 才能得出，難以滿足食品安全檢測的要求。目前，聚合酶鏈反應法(PCR)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等幾種快速檢測技術被應用于檢測致病菌，雖然比傳統方法需要的檢測時間縮短了不少，但檢測費用高、儀器昂貴；傳統的電阻抗技術亦可應用于細菌的檢測，但在分析含菌量較少樣品時， 檢測時間較長，且只有當微生物數目達到IO6-IO7個/ml時這種電阻的變化才能被記錄到， 不能滿足日常檢測要求。因此開發一種快速、簡易的適合于牛奶樣品中細菌檢測的方法在現階段極為迫切，本發明因此而來。
發明內容
本發明目的在于提供一種基于功能化納米金電極的快速檢測菌落總數的方法，該方法不需要預處理，操作簡單，結果準確，檢測時間短、費用低，解決了現有技術中檢測時間長、檢測靈敏度低、檢測費用高等問題。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是一種基于功能化納米金電極的快速檢測菌落總數的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)制備功能化納米金電極以pH為7的磷酸鹽緩沖溶液為修飾液，通過控制電位電解的方法在金電極上施加1. 8-2. 2V恒電位下電解修飾480 600s，形成金電極表面納米功能化處理的功能化納米金電極；(2)獲得標準曲線對已知濃度的標準樣品用計時電流法進行測定，得到電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系，根據電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系以細菌濃度為橫坐標，以電流響應值為縱坐標，建立細菌濃度-響應電流標準曲線；(3)以步驟⑵獲得的細菌濃度-響應電流標準曲線為參照，通過使用功能化納米金電極為工作電極的檢測器用計時電流法測定待測樣品的電流響應值，根據步驟( 獲得的細菌濃度-響應電流標準曲線獲得待測樣品的每毫升樣品細菌總數。優選的，所述方法步驟( 還包括對獲得的細菌濃度-響應電流標準曲線進行驗證的步驟；所述對獲得的細菌濃度-響應電流標準曲線進行驗證的方法包括在對已知濃度的標準樣品用計時電流法進行測定的同時通過標準平板計數法對同一標準樣品進行測定， 得到電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系，根據電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系對建立的細菌濃度-響應電流標準曲線進行校正得到校正后的細菌濃度-響應電流標準曲線。優選的，所述方法步驟( 最后得到的細菌濃度-響應電流標準曲線為一直線，對該細菌濃度-響應電流標準曲線進行擬合得到響應電流與細菌濃度的關系公式為△ I = k ★ C，其中，Δ I為樣品產生的電流與空白值電流的差值，單位為微安(μΑ) ；k為常數，C為細菌濃度，單位為細菌數/毫升(cfu · mL-1)。優選的，所述方法步驟(1)中金電極進行電解修飾前需要進行拋光清洗處理，其工序包括依次用0. 3 μ m和0. 05 μ m的Al2O3粉在絨布上對金電極進行拋光，然后用二次蒸餾水沖洗，依次在HNO3溶液、無水乙醇及二次蒸餾水中超聲波清洗處理，清洗后的金電極烘干備用。優選的，所述方法步驟(1)制備的功能化納米金電極在進行使用前需要在OV 1. 5V的范圍內循環伏安掃描至電流穩定，完成后用二次蒸餾水反復沖洗，儲存在二次蒸餾水中待用。優選的，所述方法步驟(2)對已知濃度的標準樣品進行測定的工作條件是以功能化納米金修飾電極為工作電極，鉬電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，以經高壓滅菌的0. 05 0. 15mol · Ι^、ρΗ6. 8 7. 40的磷酸緩沖溶液為電解質，工作電壓為0. 8 1. 2V，測定時將電解池置于30 40°C的恒溫水浴中，待基線電流穩定后，用無菌微量注射器將已知細菌濃度的菌懸液連續加入檢測池中進行測定。優選的，所述方法步驟(3)的檢測條件與步驟O)的條件相同，等基線電流穩定后，用微量注射器連續加入10 20μ L時待測樣品進行檢測。本發明技術方案以功能化納米金修飾電極為檢測器，利用該電極在一定的電位下能從H2O或OH—中獲得羥基自由基，使細菌細胞膜發生脂質過氧化而產生電流，電流值與樣品中細菌總數成線性關系，從而實現食品中細菌總數的快速測定。檢測結果表明優選的檢測條件是微生物濃度在5. 5 X IO2 2. 5 X IO5Cfu · mL—1響應電流與細菌濃度成良好的線性關系，檢測限為550cfu · mL—1，檢測時間在Ih以內。該方法操作簡單、重復性好、靈敏度高、不需要預處理，費用低，除磷酸鹽緩沖溶液外，幾乎不需要額外檢測試劑，有望在牛奶及其它食品的微生物檢測中得到應用。具體的，可以按照如下步驟進行第一步功能化納米金電極的制備先將金電極分別用0. 3 μ m和0. 05 μ m的Al2O3粉在絨布上拋光，用二次蒸餾水沖洗，然后依次在HNO3、無水乙醇及二次蒸餾水中超聲清洗5min，HNO3溶液中，硝酸與水的體積比為1 1，將處理后的電極置于紅外燈下烘干，以金電極為工作電極，飽和甘汞電極，即 SCE電極為參比電極，鉬電極為輔助電極，采用CHI660C型電化學工作站對金電極進行修飾，修飾液為PH為7的磷酸鹽緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0. 05 0. 15mol ·
修飾液的體積為10mL，在1. 8-2. 2V恒電位下電解480 600s，再在OV 1. 5V的范圍內循環伏安掃描至電流穩定，完成后用二次蒸餾水反復沖洗，得功能化納米金電極，儲存在二次蒸餾水中待用；第二步細菌濃度與修飾電極電流響應值關系的建立功能化納米金電極快速檢測牛奶中細菌總數，以功能化納米金修飾電極為工作電極，鉬電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，以經高壓滅菌的0. 05 0. 15mol · L—1、 PH6.8 7. 40的磷酸緩沖溶液為電解質，工作電壓為0.8 1. 2V，測定時將電解池置于 30 40°C的恒溫水浴中，待基線電流穩定后，用無菌微量注射器將不同的濃度的已知濃度的菌懸液連續加入檢測池中，用計時電流法測定電流響應值，得到電流響應和細菌數量的對應關系，以細菌濃度為橫坐標，以電流響應值為縱坐標，建立細菌濃度-響應電流曲線， 該曲線為一直線，確定細菌濃度與功能化納米電極響應電流的依從關系為線性關系；對同一樣品用標準平板計數法進行驗證，得到電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系，以細菌濃度為橫坐標，以電流響應值為縱坐標，建立細菌濃度-響應電流曲線，該曲線為一直線，確定細菌濃度與功能化納米電極響應電流的依從關系為線性關系；第三步細菌總數的快速檢測利用第二步得到的響應電流-細菌總數的線性關系，快速檢測牛奶中的細菌總數，操作步驟⑴量取經高壓滅菌的IOmL pH為6. 8 7. 4，濃度為0. 05 0. 15mol化―1的磷酸鹽緩沖溶液加入電解池中，(2)等基線電流穩定后，用微量注射器連續加入10 20yL 時樣品，用第二步所描述的工作條件用計時電流法測定其電流響應值，(3)用第二步所建立的細菌總數-電流響應的線性關系及(2)步得到的電流值計算出該電流響應值所對應的細菌濃度，從而得到樣品中細菌含量。本發明應用控制電位電解的方法在拋光洗凈的金盤電極上施加1. 8 2V電壓，所使用電解質為磷酸鹽緩沖液，只需一步操作即可完成金電極表面的納米功能化，使其表面形成了一層蓬松的納米級粗糙層，表面金原子具有很高的活性，在一定的電位下，能從H2O 或0H_中獲得羥基自由基，并吸附在電極表面，形成Au /Au OHads (Au *為活化金原子) 層。‘0H具有極高的反應活性，能夠引起微生物細胞膜脂質過氧化，在電極上產生氧化電流。電流的增加主要是因為在納米功能層的催化下生成了羥基自由基，亞甲基藍檢驗法可驗證產生的· 0H。通常情況下亞甲藍溶液顯藍色，遇到強氧化劑時失電子形成無色的3，7-雙二甲氨基吩噻嗪離子，通過亞甲藍溶液吸光度的變化可確定· OH的含量。將 0. 15mmol 亞甲藍溶液8mL和H2PO4-HPO42-緩沖溶液IOmL稀釋至IOOmL,分別以裸金電極和NPG電極為工作電極，在1. OV恒電位電解30min，取電解后的溶液測定其吸光度。發現裸金電極電解30min后亞甲基藍的吸光度略有下降，而以納米功能化金電極電解后亞甲基藍溶液吸光度值較電解前峰值明顯減小，說明在此條件下，修飾電極產生了 · 0H，使亞甲基藍失電子形成無色的3，7_雙二甲氨基吩噻嗪離子。電極上強烈的氧化還原電流對應于從水或0H_獲得· OH的過程，且· OH被吸附于電極表面，占據著電極表面的活性位點，其反應如下Au * +H2O — Au* 0Hads+H++e"Au * +OF — Au * OHads+e"細菌細胞膜主要是由脂類和蛋白質組成的雙層膜結構，其脂質分子相當穩定，但有活潑自由基存在時，就可以導致脂質過氧化的發生，從而在電極上產生電流。當將修飾電極置于含菌的PBS溶液中，電極表面活性位點的羥基自由基將會引起細菌細胞膜的脂質過氧化，細菌數量越多，產生的氧化電流越大。因此，可以根據氧化電流的變化與細菌數量變化的關系可以對牛奶中細菌總數進行快速檢測。本發明進行牛奶樣品總菌數的測定的同時，用平板計數法進行標定，建立如下
5校準曲線，細菌濃度在5. 5X IO2 2. 5X IO5Cfu · mL—1范圍內呈良好的線性關系，R = 0.9959 ；檢出限為550cfu · mL—1，比文獻的報道值要低。優選的，細菌濃度在1. IX IO3 2. 5 X IO7Cfu · mL—1范圍內，檢出限為IlOOcfu · mL—1以上檢測效果更好。相對于現有技術中的方案，本發明的優點是本發明首次將納米功能化金電極應用于牛奶中微生物的快速測定。本發明作為檢測器的功能化納米金電極制備簡單、快速、環保；樣品無需預處理；測定方法具有操作簡便；檢測時間短，檢測方法的線性范圍為5. 5X IO2 2. 5X IO5CfmlA檢出限為 550cfu ^171,檢測時間縮短至Ih以內。該方法操作簡單、重復性好、靈敏度高、不需要預處理，費用低，除磷酸鹽緩沖溶液外，幾乎不需要額外檢測試劑，有望在牛奶及其它食品的微生物檢測中得到應用。
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖1為功能化納米金電極的性能，其中A 裸金電極(a)，納米功能化金電極(b)在 0. Imol 'T1PBS (pH7. 0)中掃速為 100mV/s 的循環伏安圖；B ·0Η 與濃度為 1. 2Χ l(T5mol .171 的亞甲基藍作用的紫外吸收曲線；(a)，裸金電極，(b) 1. OV電位下氧化30分鐘的納米功能化金電極在1. 2X10_5mol · Γ1的亞甲基藍的紫外吸收曲線。圖2為測定條件的優化實驗結果；A 不同電位條件納米功能化金電極對細菌檢測的影響；B 不同PH值條件納米功能化金電極對細菌檢測的影響；圖3為電流變化的Ι-t曲線；圖4為培養基成分對測定的影響。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發明而不限于限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例1牛奶中細菌數量的快速測定1材料、試劑與儀器磷酸鹽緩沖溶液的總濃度0. Imol · L-1，pH為7. 0和7. 4。LB培養基牛肉膏3g， 蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。大腸桿菌、嗜熱鏈球菌、金黃色葡萄球菌由本校生物與食品工程學院發酵工程技術研究中心提供。牛奶樣品由常熟市圣力乳業有限公司提供。實驗所用水均為二次蒸餾水。CHI660C電化學工作站(上海辰華儀器公司)，金電極(Φ2πιπι)為工作電極，鉬電極(Φ2πιπι)為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。全自動不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器作.400Ζ型(上海三申醫療器械有限公司)，超凈工作臺S · Sff-CJ · 2F型(上海博泰實驗設備有限公司)，電熱恒溫干燥培養箱 303A-3S型(上海浦東榮豐科學儀器有限公司)。2納米功能化金電極的制備先將金電極分別用0. 3 μ m和0. 05 μ m的Al2O3粉在絨布上拋光，然后依次在體積比為1 1的HNO3、無水乙醇及二次蒸餾水中超聲清洗5min，置于紅外燈下烘干。將清潔干燥的電極置于修飾液為PH為7的磷酸鹽緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0. lmol/L中恒電位O. 0V)電解600s，再在0V-1.5V的范圍內循環伏安掃描至電流穩定，完成后用二次蒸餾水反復沖洗，得功能化納米金電極；將功能化納米金電極儲存在二次蒸餾水中待用。3細菌總數的測定方法3. 1平板計數法參照GB 4789. 2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行。3. 2計時電流法以功能化納米金修飾電極為工作電極，鉬電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，以經高壓滅菌的0. Imol · L—1、pH7. 40的磷酸緩沖溶液為電解質，體積為10mL，工作電壓為IV，用無菌的移液管準確移取IOmL經高壓滅菌的磷酸緩沖溶液測定，將電解池置于37°C的恒溫水浴中，待基線電流穩定后，用無菌微量注射器將已知細菌濃度的菌懸液連續加入檢測池中，用計時電流法測定電流響應值，結果列于表1中，在擬合公式中，k = 1. 761Χ10Λ對同一樣品分別用標準平板計數法和計時電流法同時進行測定，通過標準平板計數法的數值對計時電流法測定的電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系進行校正，建立校正工作曲線。表1響應電流與細菌濃度之間的線性關系
權利要求
1.一種基于功能化納米金電極的快速檢測菌落總數的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)制備功能化納米金電極以PH為7的磷酸鹽緩沖溶液為修飾液，通過控制電位電解的方法在金電極上施加1. 8-2. 2V恒電位下電解修飾480 600s，形成金電極表面納米功能化處理的功能化納米金電極；(2)獲得標準曲線對已知濃度的標準樣品用計時電流法進行測定，得到電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系，根據電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系以細菌濃度為橫坐標，以電流響應值為縱坐標，建立細菌濃度-響應電流標準曲線；(3)以步驟(2)獲得的細菌濃度-響應電流標準曲線為參照，通過使用功能化納米金電極為工作電極的檢測器用計時電流法測定待測樣品的電流響應值，根據步驟(2)獲得的細菌濃度-響應電流標準曲線獲得待測樣品的每毫升樣品細菌總數。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)還包括對獲得的細菌濃度-響應電流標準曲線進行驗證的步驟；所述對獲得的細菌濃度-響應電流標準曲線進行驗證的方法包括在對已知濃度的標準樣品用計時電流法進行測定的同時通過標準平板計數法對同一標準樣品進行測定，得到電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系，根據電流響應和牛奶中細菌數量的對應關系對建立的細菌濃度-響應電流標準曲線進行校正得到校正后的細菌濃度-響應電流標準曲線。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)最后得到的細菌濃度-響應電流標準曲線為一直線，對該細菌濃度-響應電流標準曲線進行擬合得到響應電流與細菌濃度的關系公式為Δ I= k*C，其中，ΔΙ為樣品產生的電流與空白值電流的差值， 單位為微安(μ Α) ；k為常數，C為細菌濃度，單位為細菌數/毫升(cfu · mL—1)。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步驟(1)中金電極進行電解修飾前需要進行拋光清洗處理，其工序包括依次用0. 3 μ m和0. 05 μ m的Al2O3粉在絨布上對金電極進行拋光，然后用二次蒸餾水沖洗，依次在HNO3溶液、無水乙醇及二次蒸餾水中超聲波清洗處理，清洗后的金電極烘干備用。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步驟(1)制備的功能化納米金電極在進行使用前需要在OV 1. 5V的范圍內循環伏安掃描至電流穩定，完成后用二次蒸餾水反復沖洗，儲存在二次蒸餾水中待用。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)對已知濃度的標準樣品進行測定的工作條件是以功能化納米金修飾電極為工作電極，鉬電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，以經高壓滅菌的0. 05 0. 15mol ·Ι^、ρΗ6. 8 7. 40的磷酸緩沖溶液為電解質，工作電壓為0. 8 1. 2V，測定時將電解池置于30 40°C的恒溫水浴中，待基線電流穩定后，用無菌微量注射器將已知細菌濃度的菌懸液連續加入檢測池中進行測定。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步驟(3)的檢測條件與步驟(2) 的條件相同，等基線電流穩定后，用微量注射器連續加入10 20 μ L時待測樣品進行檢測。
全文摘要
本發明公開了一種基于功能化納米金電極的快速檢測菌落總數的方法，將納米功能化金電極應用于牛奶中微生物的快速測定，本發明作為檢測器的功能化納米金電極制備簡單、快速、環保；樣品無需預處理；測定方法具有操作簡便；檢測時間短，檢測方法的線性范圍為5.5×102~2.5×105cfu·mL-1，檢出限為550cfu·mL-1，檢測時間縮短至1h以內。該方法操作簡單、重復性好、靈敏度高、不需要預處理，費用低，除磷酸鹽緩沖溶液外，幾乎不需要額外檢測試劑，有望在牛奶及其它食品的微生物檢測中得到應用。
文檔編號C12Q1/06GK102392069SQ20111032709
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者尹凡, 屠一鋒, 汪學英, 顧鋒 申請人:常熟理工學院