一種苦蕎麥葉片的遺傳轉化方法

專利名稱：一種苦蕎麥葉片的遺傳轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種農桿菌介導的植物遺傳轉化方法，特別是涉及一種農桿菌介導的苦蕎麥葉片的遺傳轉化方法。
背景技術：
蕎麥是一種藥食同源的植物，有苦蕎和甜蕎兩種。由于苦蕎其籽粒、根、莖、葉及花等多種器官中都含有大量黃酮類物質，因而被譽為“降血糖、降血壓、降血脂”的三降食品。 隨著其營養價值和藥用價值的不斷發現，苦蕎麥植物資源越來越受到人們的青睞。由于苦蕎麥植物自花授粉的特點使其在生產育種上人工雜交難以成功，因此目前苦蕎麥在育種方面仍未獲得重大突破。目前借助發根農桿菌Ri質粒介導植物進行遺傳轉化的研究已成為近些年的研究熱點。發根農桿菌中含有致使植物產生毛狀根的Ri質粒，在Vir區基因產物的協助下，Ri 質粒中的T-DNA片段能轉移進植物核基因組中，導致轉化成功的植物產生大量的毛狀根。 毛狀根具有生長速度快，不需要添加外源激素，并能提供大量可藥用的次生代謝產物的特征。農桿菌Ri質粒上攜帶的生根基因不僅能使被感染植物部位產生大量的毛狀根，而且由產生的毛狀根還可以獲得再生的轉化植株，這些植株可表現出許多穩定遺傳的表現變異。目前已有關于發根農桿菌介導的蕎麥植物遺傳轉化方面研究的報道，如黃萱的博士論文《小麥NBS-LRR抗性基因克隆以及基因槍介導的遺傳轉化和由發根農桿菌介導的苦蕎遺傳轉化》和金紅的論文《關于發根農桿菌A4對蕎麥的遺傳轉化》。從這些報道可發現， 目前在由發根農桿菌介導蕎麥植物的遺傳轉化中所采用的外植體只有子葉、莖尖和下胚軸較幼嫩的植物器官。采用植物幼嫩器官作為外植體，雖然因細胞壁較薄，能促使農桿菌的 T-DNA更易進入被轉化的細胞中而使其轉化成功；但另一方面，由于植物幼嫩器官的細胞分化程度較低，細胞中所產生的次生代謝產物也較低，所以誘導產生的毛狀根中的次生代謝產物的含量也較低。

發明內容
本發明的目的在于一種苦蕎麥葉片的遺傳轉化方法，該方法能產生含有大量次生代謝產物的毛狀根。為達到上述目的，本發明采用的解決方案由如下步驟構成菌種的活化培養將農桿菌劃線接種于YEB固體培養基上培養1 2天后，用接種環挑取生長良好的單菌接入YEB液體培養基中震蕩培養1 2天至菌液0D_ = 0. 2 0. 6，所述農桿菌為發根農桿菌Ri 1601，培養溫度為25 30°C ； 無菌苗的獲得將苦蕎種子的種皮剝去，先用75%的酒精消毒30 60s，再用 0. 升汞消毒3 lOmin，然后用無菌水沖洗2 5次后，接種于不加激素的MS培養基上， 在22 28°C、光照強度1000 20001x，、每天光照8 12h的條件下進行培養；遺傳轉化培養選取葉齡在2 30天、生長狀況良好的苦蕎麥無菌苗葉片作為外植體，先將外植體接種于預培養基MS+2，4-D 0. 5 4mg · L^+6-BA 0. 1 1. 5mg · L^+NAA 0 Img · L—1+乙磺酸0 Ig · L—1+蔗糖15 50g · L—1中進行0 4天的預培養，然后將其取出放入上述制得的農桿菌菌液中浸染2 18min，使外植體與農桿菌充分接觸，取出外植體，用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，再轉入不加激素的MS培養基上進行0 4 天的共培養，接著再轉入含有頭孢噻肟鈉200 500mg/L的脫菌水中浸洗2 6min，然后用無菌濾紙吸干脫菌水后，將其轉接入除菌培養基MS+頭孢噻肟鈉300 600mg/L+瓊脂6 8g/L+蔗糖15 40g/L中進行除菌培養，每隔5-7天轉接一次，直到產生大量毛狀根。上述不加激素的MS培養基為MS+瓊脂6 8g/L+蔗糖15 50g/L。本發明由于采用分化程度相對較高且黃酮類物質含量最高的苦蕎葉片作為外植體，因此大大提高了毛狀根中次生代謝產物的含量，為苦蕎麥有效組分的快速生產提供了一種新的途徑。
具體實施方式
實施例1(1)菌種的活化培養將發根農桿菌Ril601劃線接種于YEB固體培養基上培養1 天后，用接種環挑取生長良好的單菌接入YEB液體培養基中，于28°C振蕩培養1天左右至菌液 OD600 = 0 . 5 ；(2)無菌苗的獲得將苦蕎種子的種皮剝去，放在超凈工作臺上，先用75%的酒精消毒40s，再用0. 升汞消毒5min，然后用無菌水沖洗4次后，接種于MS固體培養基上，在 25°C、光照強度12001x，、每天光照IOh的條件下進行培養，獲得苦蕎麥無菌苗；(3)遺傳轉化培養選取葉齡在12天左右、生長狀況良好的苦蕎麥無菌苗葉片作為外植體，先將外植體接種于預培養基MSiZd-DZmg^L-1+6-BA 0. 3mg'L^+NAA 0. Img ·Γ1+ 乙磺酸0. 5g · Γ1+蔗糖30g · Γ1中，在25°C預培養3天，然后將其取出放入上述制得的農桿菌菌液中浸染12分鐘，使外植體與農桿菌充分接觸，取出外植體，用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，再轉入培養基MS+瓊脂6. 8g/L+蔗糖30g/L上進行2天的共培養，接著再轉入含有頭孢噻肟鈉400mg/L的脫菌水中浸洗5min，然后用無菌濾紙吸干脫菌水后，將其轉接入除菌培養基MS+頭孢噻肟鈉500mg/L+瓊脂6. 8g/L+蔗糖30g/L鈉中進行除菌培養，每隔5-7天轉接一次，培養25天后產生大量毛狀根。實施例2將實施例1步驟(3)中所選取的外植體改為葉齡為30天、生長狀況良好的苦蕎麥葉片，其它步驟同實施例1 ；培養25天后統計毛狀根轉化率低于實施例1。說明處于不同生長階段的外植體，在用農桿菌進行遺傳轉化的過程中，組成器官的細胞所處于的感受態是不同的；通常生長期越長的器官，其細胞的分化程度也就越高，細胞也就越不容易調整到農桿菌T-DNA易于進入的感受狀態，因而會使毛狀根的轉化率較低。實施例3本實施例省去了實施例1步驟(3)中所述的預培養步驟，將從苦蕎麥無菌苗上選取的葉片直接浸染到農桿菌液中進行毛狀根誘導處理，其它步驟同實施例1，培養25天后統計毛狀根轉化率明顯低于實施例1。說明在農桿菌介導的遺傳轉化過程中，經過預培養處理可以有效地減輕農桿菌在轉化過程中對外植體產生的傷害，并能使外植體細胞調整到適宜農桿菌誘導轉化的狀態。實施例4
本實施例省去了實施例1步驟(3)中所述的共培養步驟，其它步驟同實施例1，培養25天后統計毛狀根轉化率明顯低于實施例1。說明取消共培養步驟雖然也能產生毛狀根，但毛狀根轉化率較低。
權利要求
1. 一種苦蕎麥葉片的遺傳轉化方法，其特征在于包括如下步驟 菌種的活化培養將農桿菌劃線接種于YEB固體培養基上培養1 2天后，用接種環挑取生長良好的單菌接入YEB液體培養基中震蕩培養1 2天至菌液OD6tltl = 0. 2 0. 6，所述農桿菌為發根農桿菌Ril601，培養溫度為25 30°C ；無菌苗的獲得將苦蕎種子的種皮剝去，先用75%的酒精消毒30 60s，再用0. 升汞消毒3 lOmin，然后用無菌水沖洗2 5次后，接種于不加激素的MS培養基上，在22 28°C、光照強度1000 20001x，、每天光照8 12h的條件下進行培養；遺傳轉化培養選取葉齡在2 30天、生長狀況良好的苦蕎麥無菌苗葉片作為外植體， 先將外植體接種于預培養基MS+2，4-D 0. 5 4mg · L_1+6-BA 0· 1 1. 5mg · I^+NAA O Img -L"1+乙磺酸O Ig 蔗糖15 50g -L"1中進行O 4天的預培養，然后將其取出放入上述制得的農桿菌菌液中浸染2 18min，使外植體與農桿菌充分接觸，取出外植體， 用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，再轉入不加激素的MS培養基上進行O 4天的共培養，接著再轉入含有頭孢噻肟鈉200 500mg/L的脫菌水中浸洗2 6min，然后用無菌濾紙吸干脫菌水后，將其轉接入除菌培養基MS+頭孢噻肟鈉300 600mg/L+瓊脂6 8g/L+ 蔗糖15 40g/L中進行除菌培養，每隔5-7天轉接一次，直到產生大量毛狀根。
全文摘要
本發明公開了一種苦蕎麥葉片的遺傳轉化方法，該方法包括如下步驟(1)將發根農桿菌接入YEB培養基中，制備所需的菌液；(2)將苦蕎種子接種于不加激素的MS培養基中獲得無菌苗；(3)取無菌苗葉片作為外植體，將外植體通過預培養后，浸入已活化的農桿菌菌液中，使外植體與農桿菌充分接觸后，取出外植體轉入不加激素的MS培養基上進行共培養，最后轉接入含有頭孢噻肟鈉的除菌培養基中進行除菌培養，直到產生大量毛狀根。本發明可大大提高毛狀根中次生代謝產物的含量。
文檔編號C12N15/84GK102352378SQ20111032438
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月23日 優先權日2011年10月23日
發明者孫雁霞, 張紅玉, 彭鐮心, 湯有舉, 王躍華, 胡一冰, 趙鋼, 鄔曉勇, 鄒亮, 陳燕 申請人:成都大學