專利名稱：具有wnk激酶抑制作用的重組穿膜肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有WNK (激酶域無賴氨酸的絲蘇氨蛋白激酶)激酶抑制作用的重組穿膜肽及其應用。
背景技術：
疼痛(pain)是一種復雜的生理心理活動，是臨床上最常見的癥狀之一。它包括傷害性刺激作用于機體所引起的痛感覺，以及機體對傷害性刺激的痛反應(軀體運動性反應和/或內臟植物性反應，常伴隨有強烈的情緒色彩)。痛覺可作為機體受到傷害的一種警告，引起機體一系列防御性保護反應。但另一方面，疼痛作為報警也有其局限性(如癌癥等出現疼痛時，已為時太晚)。而某些長期的劇烈疼痛，對機體已成為一種難以忍受的折磨。 因此，鎮痛是醫務工作者面臨的重要任務。疼痛通常由導致組織損傷的傷害性刺激引起。刀割、棒擊等機械性刺激，電流、 高溫和強酸、強堿等物理化學因素均可成為傷害性刺激。組織細胞發炎或損傷時釋入細胞外液中的鉀離子、5-羥色胺、乙酰膽堿、緩激肽、組胺等生物活性物質亦可引起疼痛或痛覺過敏。全身皮膚和有關組織中分化程度最低的游離神經末梢，作為傷害性感受器，將各種能量形式的傷害性刺激轉換成一定編碼型式的神經沖動，沿著慢傳導的直徑較細的有髓鞘和最細的無髓鞘傳入神經纖維，經背根神經節傳到脊髓后角或三叉神經脊束核中的有關神經元，再經由對側的腹外側索傳至較高級的疼痛中樞——丘腦、其他腦區以及大腦皮質，引起疼痛的感覺和反應。痛覺信息傳遞中，Y-氨基丁酸(GABA)在背根神經節(DRG)中是最重要的興奮性遞質。在發生神經病理性痛中DRG神經元細胞內[Cl-]i較高，神經元的翻轉電位既高于靜息電位，也高于動作電位產生閾值，因此當GABA作用于GABAa受體使通道開放時，Cl—流出神經元，使神經元膜發生去極化。Na+-K+-Cr共轉運體1 (NKCCl)活性增強是導致DRG神經元內Cl_高的關鍵，因此抑制NKCCl的活性就成為開發新的鎮痛藥物的關鍵。而NKCCl的活性主要受其自身磷酸化的調節，WNK激酶可顯著促進NKCCl的磷酸化使其活性大大提高，因本發明可顯著抑制WNK激酶活性并因此抑制NKCCl的活性，故具有顯著的鎮痛效應。因本發明不像一些從天然毒素中提取的離子通道阻斷劑那樣直接作用于離子通道，因此副作用較小，鎮痛作用較久。像N-型鈣通道阻斷劑芋螺毒素SNX-I I I鎮痛效果雖然較好，但在高劑量時SNX-III會引起明顯的運動障礙，并且這種副作用隨劑量的增加而增強，具有很大的危險性。同樣，目前美國已批準生產2種蛇神經毒素類藥物一種是 Cobroxin，主治頑固性神經痛及惡性腫瘤痛；另一種是Ngloxin，主治關節痛。；其作用于中樞神經系統內的M型和N型Ach受體，產生鎮痛作用，但也有極大的中毒死亡的危險。
發明內容
本發明目的之一在于提供一種具有WNK激酶抑制作用的重組穿膜肽。本發明的目的之二在于提供該重組穿膜肽的制備方法。本發明的目的之三在于提供該重組穿膜肽在制備鎮痛藥物中的應用。
為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
一種具有WNK激酶抑制作用的重組穿膜肽，其特征在于該編碼蛋白為SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。一種制備上述的具有WNK激酶抑制作用的基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為將含有HIVl (艾滋病毒)的Tat (轉錄反式激活因子)蛋白中最小的一段轉位穿膜結構域序列，即 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Arg Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln序列，插入相應LING0-1 (具有 LRR結構和免疫球蛋白結構域的Nogo受體作用蛋白1)分子胞內域(氨基酸殘基582 - 620)N-末端；再經體外大腸桿菌BL21系統表達并經純化，即得到代號為TAT-LIC肽的具有WNK激酶抑制作用的重組穿膜肽。上述的具有WNK激酶抑制作用的重組穿膜肽在制備鎮痛藥物中的應用。本發明提出藥物組合物由具有活性成分的TAT-LIC肽和藥學上可以接受的載體組成。其中活性成分的重量含量為0. 1-99. 9%。 該基因作為WNK絲蘇氨酸激酶的特異性抑制劑，與WNK結合后，可使受WNK活化的 NKCCl活性降低，從而特異性使脊髓背根神經節和三叉神經節神經元胞外Cl—增多，抑制痛覺的傳遞。
圖1為TAT-LIC肽可做為特異性的WNK激酶的抑制劑，抑制WNK激酶的活性。圖2為TAT-LIC肽可做為特異性的WNK激酶的抑制劑，抑制WNK激酶的活性，繼而抑制了 NKCCl的磷酸化抑制NKCCl活性。
具體實施例方式下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例1 制備TAT-LIC肽
LIC肽(LING0-1，intracellular domain)對應人類 LING0-1 分子氨基酸序列 580-620， 來自以全長結構pEGFP-Nl-hLINGO-Ι為模板的亞克隆。融合蛋白TAT-LIC肽的產生是將含有HIVl的Tat蛋白中最小的一段轉位結構域序列(MRGSHHHHHHGMARGYGRKKRRQRRRPQ)正確插入相應LIC cDNA的N-末端。融合蛋白經體外BL21系統表達并用鎳親和層析柱按經典方法純化。
實施例2 =SD大鼠脊髓背根神經節神經元的培養
脊髓背根神經節的取材與培養將E16孕鼠乙醚麻醉后無菌取其胚胎，放入4 0CPBS 液中，在解剖顯微鏡下暴露SD胎鼠的椎管和椎間孔，用鑷子將脊髓連帶兩旁的DRG —起取出放入PBS液中，用顯微鏡逐個摘除DRG，并盡量剝除神經節表面的筋膜，放入35mm培養皿中，眼科剪將神經節剪碎后移入2mL 0. 25 %TrypSin消化液的離心管中，在37 °〇的 C02培養箱中消化20min后，吸去消化液，直接加入含10 % FBS的DMEM培養基終止消化反應，離心后棄上清，用DMEM培養基重懸細胞，將其制成單細胞懸液，以IO5個/ mL的密度接種于用多聚賴氨酸包被處理的35mm培養皿中，于37 °C、5 % C02培養箱中培養 3小時后換NBl培養基(NBl培養基組分為Neurobasal培養基補充加入4. 5g / L D —葡萄糖，2mmol / L谷氨酰胺，1% FBS, 2% B27添加劑，IOug / L⑶NF)。每周換液2次。實施例3 =TAT-LIC肽處理原代培養的SD大鼠脊髓背根神經節神經元，可以顯著抑制WNK激酶的磷酸化，即抑制WNK激酶的活性。(見圖1)
具體實驗過程為在實施例2中取得的原代培養的SD大鼠脊髓背根神經節神經元， 用TAT-LIC肽(終濃度為IOOnM)或對照肽(終濃度為IOOnM)處理3小時。用PBS清洗兩次加入 RIPAI 組織裂解液(20mM Tris-HCI, pH 7. 5,137mM NaCI,50mM NaF,0. 02%NaN3, l%NP-40,2mM EDTA,2mM benzamidine,ImM PMSF,2pg/ml pepstatin A,2pg/ml leupeptin, 4 pg/ml antipain，2pg/ml aprotinin, 2mM DTT)及磷酸酶抑制劑。細胞經手工冰上勻漿， 勻漿液于4°C 14, 000 rpm離心10 min，取上清。免疫共沉淀和Western blot檢測 取500μ1上述細胞裂解液，加IP抗體(5 yg每反應)，在4°C翻轉孵育1-3 h后加入 20 μ 1 protein G-agarose (Roche Molecular Biochemicals) ^ΜΛ^^· 4°CIlIP W 12 ho 12000 rpm 離心 2 min，棄上清，免疫沉淀物用 IP bufe (r20 mM Tris-HCI
pH 7. 5,2 mM EGTA，150 mM NaCl, 1%ΝΡ-40, ImM DTT)洗三次，棄上清。然后重懸在 2X 蛋白質電泳上樣緩沖液中，進行1 的SDS-PAGE電泳。濕法將蛋白條帶轉移到硝酸纖維素膜上,用含 5% 脫脂奶粉的 TBS-T (10 mM Tris-HCI(pH 7. 5 )，150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)溶液封閉膜2-;3hr，一抗4°C結合過夜，用TBS-T室溫洗膜四次，每次15min。 用二抗于室溫結合2-!3hr，再用TBS-T洗膜四次，每次15min。用吸水紙吸盡多余的液體， 用SuperSignal ECL試劑顯色。用Kodark X-ray底片壓片，曝光30秒至5分鐘后顯影。實施例4 =TAT-LIC肽處理原代培養的SD大鼠脊髓背根神經節神經元，可以顯著抑制WNK激酶的活性，從而造成WNK激酶底物的NKCCl蛋白磷酸化減少，NKCCl蛋白活性降低。(見圖2)
具體實驗過程同實施例3。實施例5 小鼠熱板實驗
選用雌性小鼠，將小鼠放在(55 士 1) °C的熱板上，測定每鼠的痛閾(即痛反應潛伏期，指小鼠從足接觸熱板到舔足和跳躍后足所用時間)，共測兩次，每次間隔5 min,選擇痛反應潛伏期在5 30 s的小鼠為合格鼠，剔除過敏(< 5 s)或反應遲鈍(> 30 s)的個體。M h后進行實驗，取合格小鼠60只，隨機分成三組每組20只生理鹽水對照組； 對照肽組(編碼無關氨基酸序列，不會抑制WNK激酶)TAT-LIC肽組。將小鼠置于55°C的熱板上，首先測定4個實驗組的基礎痛閾，給藥前測兩次(間隔10 min)，取其平均值， 然后腹腔注射給藥0. 4 ml/只(含肽Img)。在給藥后30 min給藥后1 h開始分別在第 30、60、90、120、150 min時測定痛覺反應時間兩次，取平均值。表1、TAT-LIC肽對小鼠熱板實驗鎮痛作用的影響Γ Χ 士W注TAT-LIC肽組與對照肽組及生理鹽水組相比，001
該結果說明TAT-LIC肽具有顯著的對熱等物理痛的鎮痛作用，大鼠接受TAT-LIC肽后對熱痛不再敏感，反應時間延長，痛域上調。
實施例6 小鼠扭體實驗
取60只小鼠，雌性，隨機分為3組，即生理鹽水對照組；對照肽組TAT-LIC肽組。 給藥方法同熱板法給藥方案。在給藥后30 min進行實驗。3組小鼠均腹腔注射0. 6%的醋酸0. 2 ml，記錄各組小鼠的在15 min (注射0. 6%的醋酸后5 20 min)內扭體的次數。 抑制率=(生理鹽水組扭體均數-給藥組扭體均數)/生理鹽水組扭體均數X 100 %。
表2、TAT-LIC肽在小鼠扭體反應實驗中的作用(η=10 χ 士W
實驗組扭體次數/l&nin抑制率(%)生理鹽水組38. 23±6. 24ND對照肽組42. 11±8. 15NDTAT-LIC 肽組13. 86±2. 62**63. 74%
注TAT-LIC肽組與對照肽組及生理鹽水組相比，** P < 0. 001 該結果說明TAT-LIC肽具有顯著的對酸等化學炎性痛的鎮痛作用，大鼠接受TAT-LIC 肽后對化學炎性痛不再敏感，反應次數減少，痛域上調。 因本發明可顯著抑制WNK激酶活性并因此抑制NKCCl的活性，從而抑制由Y -氨基丁酸(GABA)引起的DRG神經元膜去極化，抑制痛覺信息的傳遞。故具有顯著的鎮痛效應。 動物實驗也證明了其鎮痛作用。
權利要求
1.一種具有WNK激酶抑制作用的重組穿膜肽，其特征在于該編碼蛋白為SEQ ID NO. 1 所示的氨基酸序列。
2.一種制備根據權利要求1所述的具有WNK激酶抑制作用的重組穿膜肽的方法，其特征在于該方法的具體步驟為將含有艾滋病毒HIVl的轉錄反式激活因子Tat蛋白中最小的一段轉位穿膜結構域序列，即 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Arg Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln序列，插入相應LING0-1 分子胞內域氨基酸殘基582 - 620N-末端；再經體外大腸桿菌BL21系統表達并經純化，即得到具有WNK激酶抑制作用的重組穿膜肽。
3.根據權利要求1所述的具有WNK激酶抑制作用的重組穿膜肽在制備鎮痛藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種具有WNK激酶抑制作用的重組穿膜肽及其應用。該基因為SEQID NO.1所示的氨基酸序列。該重組穿膜肽作為WNK絲蘇氨酸激酶的特異性抑制劑，與WNK結合后，可使受WNK活化的NKCC1活性降低，從而特異性使脊髓背根神經節和三叉神經節神經元胞內Cl-減少，抑制GABA在背根神經節(DRG)中的興奮性作用，抑制痛覺的傳遞。
文檔編號C12N15/70GK102408484SQ201110322259
公開日2012年4月11日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者張照環, 徐曉輝, 黃海 申請人:上海大學