專利名稱：N-乙酰神經氨酸醛縮酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及N-乙酰神經氨酸醛縮酶及其編碼基因與應用。
背景技術：
唾液酸(Sialic acid)是一類神經氨酸的衍生物，目前已經發現的天然的唾液酸衍生物達40多種。其中最主要的是N-乙酰神經氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid,NeuSAchNeuSAc通常位于細胞表面糖蛋白和糖脂的糖鏈非還原末端，在許多與糖和蛋白相互作用有關的生理過程中起著很重要的作用如細胞的粘附、信號傳遞、糖蛋白的穩定性、細菌致病性、病毒侵染、炎癥和腫瘤的轉移等。N-乙酰神經氨酸的生物學功能多樣化，在治療流感、神經性疾病、炎癥和腫瘤等方面具有重要的醫藥價值，特別是在流感(包括禽流感H5N1和2009年的H1N1)的預防和治療方面有良好的效果。同時，N-乙酰神經氨酸可促進神經突觸的發育，對嬰幼兒腦部發育非常重要，因此也被用于嬰幼兒奶粉添加劑。無論是藥用前景還是作為食品添加劑，N-乙酰神經氨酸都具有較高的市場價值。N-乙酰神經氨酸可從以下幾種途徑獲得天然產物提取、化學合成、化學酶法、酶法合成等。N-乙酰神經氨酸可從燕窩、牛奶或者禽蛋中提取，但由于量太少，提取純化難，產量低(10-20% )，純度低。化學合成法合成N-乙酰神經氨酸，由于產物結構的復雜性，需要繁多的保護和去保護步驟。使用化學法合成N-乙酰神經氨酸反應條件苛刻，需要銦等一些貴重金屬作為催化劑，N-乙酰神經氨酸得率低。因此，化學法常常和酶法結合使用。N-乙酰神經氨酸 可通過酶法合成，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸在N-乙酰神經氨酸醒縮酶(Neu5Ac aldolase or Neu5Ac lyase,NanA,EC4.1. 3· 3)作用下生成 N_ 乙酰神經氨酸。但ManNAc對于工業生產而言成本較高。化學酶法是一種更經濟有效的生產N-乙酰神經氨酸的方法，即在堿性條件下，使GlcNAc異構化生成ManNAc ;然后采用N-乙酰神經氨酸醛縮酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經氨酸。或用雙酶法合成SP用 GlcNAc 2_ 異構酶(GlcNAc 2-epimerase,AGE,EC5.1. 3. 8)催化 GlcNAc 異構成 ManNAc,然后ManNAc和丙酮酸在N-乙酰神經氨酸醛縮酶的作用下縮合產生Neu5Ac。在工業生產中多以GlcNAc為原料生產Neu5Ac，不論是采用化學酶法還是雙酶法，都需要N-乙酰神經氨酸醛縮酶。雖然N-乙酰神經氨酸醛縮酶在高等動物及一些微生物中有存在，但是生物體中其含量極微，難以分離得到足夠量的N-乙酰神經氨酸醛縮酶。因此如何獲得性質優良的N-乙酰神經氨酸醛縮酶對N-乙酰神經氨酸的生產非常重要。
發明內容
本發明的一個目的是提供N-乙酰神經氨酸醛縮酶及其編碼基因。本發明所提供的N-乙酰神經氨酸醛縮酶，名稱為SaNanA，來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),是如下 a)或 b)的蛋白質a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由a)衍生的蛋白質。本發明所提供的N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因，為如下I)或2)或3)所示I)其核苷酸序列是序列表中序列I所示DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
O.1 % SDS 和 I X SSC, O.1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由882個核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白質。序列表中序列2由293個氨基酸殘基組成。含有所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。所述重組表達載體為在載體6HisT_pRSET的多克隆位點插入所述編碼基因得到的重組表達載體。所述重組菌為將所述編碼基因導入宿主菌得到的重組菌；所述編碼基因是通過所述的重組表達載體導入宿主菌中的；所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。擴增所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。 所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶、所述編碼基因、所述重組表達載體或所述表達盒、轉基因細胞系或重組菌在制備N-乙酰神經氨酸中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明以金黃色葡萄球菌總DNA為模板，用PCR擴增獲得一個編碼N-乙酰神經氨酸醛縮酶的新基因SananA。將SananA基因克隆到原核表達載體6HisT_pRSET質粒上，在大腸桿菌中進行N-乙酰神經氨酸醛縮酶蛋白(SaNanA)的高效表達。獲得的重組N-乙酰神經氨酸醛縮酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經氨酸，具有較高的酶活性，具有較高的應用前景及開發價值。
圖1為SananA的PCR擴增結果。圖2為重組質粒pSananA的酶切鑒定結果。圖3為基因工程菌pSananA/BL21表達產物的SDS-PAGE分析。圖4為SaNanA純化后的SDS-PAGE分析。圖5為轉化產物的HPLC圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、N-乙酰神經氨酸醛縮酶的制備及功能驗證一、金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取和SaNanA基因的PCR擴增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，CGMCC1. 1529)，采用細菌基因組提取試劑盒(天根公司)提取金黃色葡萄球菌基因組DNA。以提取金黃色葡萄球菌基因組總DNA作為模板，以Sa-F和Sa-R為引物，用高保真pyrobest酶(Takara公司)PCR擴增SaNanA基因。引物序列如下Sa-F :5’ -GCGCGACCATATGAACAAAGATTTAAAAGG-3> (下劃線表示 NdeI 酶切位點)，Sa-R 5，-GCGGGATCCCTATAAATCGTATTTTGCAATG-3，(下劃線表示 BamHI 酶切位點)。PCR 程序為
權利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質 a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由a)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下I)或2)或3)所示 1)其核苷酸序列是序列表中序列I所示DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為在載體6HisT-pRSET的多克隆位點插入所述編碼基因得到的重組表達載體。
6.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權利要求2或3所述的編碼基因導入宿主菌得到的重組菌；所述權利要求2或3所述的編碼基因是通過權利要求4或5所述的重組表達載體導入宿主菌中的。
7.擴增權利要求2或3所述編碼基因全長或其任一片段的引物對，所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
8.權利要求1所述的蛋白、權利要求2或3所述的編碼基因、權利要求4-6中任一所述的重組表達載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系在制備N-乙酰神經氨酸中的應用。
全文摘要
本發明公開了N-乙酰神經氨酸醛縮酶及其編碼基因與應用。本發明所提供的N-乙酰神經氨酸醛縮酶是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由a)衍生的蛋白質。本發明獲得了一個編碼N-乙酰神經氨酸醛縮酶的新基因SananA。將SananA基因克隆到原核表達載體6HisT-pRSET質粒上，在大腸桿菌中進行N-乙酰神經氨酸醛縮酶蛋白(SaNanA)的高效表達。本發明所獲得的重組N-乙酰神經氨酸醛縮酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經氨酸，具有較高的酶活性，具有較高的應用前景及開發價值。
文檔編號C12N1/19GK103060300SQ20111032202
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月20日 優先權日2011年10月20日
發明者林白雪, 張子娟, 陶勇 申請人:中國科學院微生物研究所