專利名稱：菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因及其重組蛋白和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗菌肽，具體涉及一種菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因及其重組蛋白、以及構建方法和應用。
背景技術：
抗菌肽是生物體產生的一類由20-60個氨基酸組成的多肽，對真菌、細菌等病原微生物具有抑制或殺滅作用，通常被稱為“第二防御體系”。根據抗菌肽結構和三維構象的差異，可將抗菌肽分為以下四類(1)具有α螺旋結構的線性肽，如蜂毒肽、蛙皮肽、天蠶抗菌肽等；(2)含有二硫鍵的β折疊結構，如防御素、昆蟲防御肽等；(3)由一種或多種氨基酸為主構成的多肽，如富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)前體蛋白剪切而來的多肽，如淡水螯蝦(Pacifastacus leniusculus)的血藍蛋白C-端酶解后可產生具有抗菌活性的多肽。這類分子具有一些共同的特點在生物體內合成迅速；具有廣譜抗菌活性，對細菌、真菌、原生動物等有作用，但對真核細胞無毒害；分子量一般在IOkDa以下；多數是陽離子分子。抗菌肽的作用機理與傳統抗生素不同，它們的靶位點主要是病原體的細胞膜以增加膜的滲透性，因此不易產生抗性。抗菌肽不僅作用于革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌，還可以殺滅真菌、病毒、寄生蟲和腫瘤細胞，同時還能加速免疫和傷口愈合過程。由于病原菌對抗生素逐步產生抗藥性，抗菌肽為開發新的抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤藥物開辟了廣闊的前景。在海洋貝類中，貽貝的抗菌肽研究較為透徹，根據其一級結構和二硫鍵形成的不同形式，貽貝抗菌肽又可分為四種類型防御素(defensins)、貽貝素 (mytilins)、貽貝肽(myticins)和貽貝霉素(mytimycins)。目前國內外關于菲律賓蛤仔抗菌肽及其抗菌活性的研究較少。趙建民等利用大腸桿菌原核表達系統，體外重組表達菲律賓蛤仔大防御素(VpBD)蛋白，具有廣譜的抗革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌。
發明內容
本發明目的在于提供一種菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因及其重組蛋白、以及構建方法和應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因所述防御素Defensin A基因為序列表 SEQ ID NO. 1中堿基序列所示。一種菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因重組蛋白所述防御素Defensin A基因重組蛋白為序列表SEQ ID NO. 2中氨基酸序列所示。菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因重組蛋白的應用所述防御素Defensin A基因重組表達產物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。所述防御素Defensin A基因重組表達產物可作為制備革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的抑菌藥物。革蘭氏陽性菌為巴氏葡萄球菌或金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌或副溶血弧菌。
本發明所具有的優點1.本發明從菲律賓蛤仔中克隆到防御素Defensin A的全長cDNA序列，實現其重組表達并測定其抗菌譜和最小抑菌濃度，為菲律賓蛤仔的病害防治、基因輔助選育及進一步開發為醫藥產品和保鮮防腐劑奠定基礎。2.與現有技術相比，本發明的防御素Defensin A為菲律賓蛤仔抗菌肽，對海洋來源的多種革蘭氏陽性和陰性病原微生物均具有很強的抑制活性，具有開發為廣譜抗菌類藥物、遺傳選育和飼料添加劑等方面的應用價值。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。本發明菲律賓蛤仔防御素Defensin A的制備方法1)總RNA提取用Trizol試劑從感染鰻弧菌的菲律賓蛤仔的血淋巴中提取總 RNA，存于_80°C備用；提取方法依hvitrogen公司的Trizol試劑說明書進行；2)mRNA純化用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA ；純化方法依據QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說明書進行；3) cDNA模板制備用cDNA合成試劑盒(購于Mratagene公司)將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，具體操作方法依試劑盒說明書進行包括雙鏈cDNA經末端補平、 EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Bio I內切酶酶切等，用QIAEX II膠純化試劑盒(購于QIAGEN公司)對大于IOObp的酶切片段進行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR載體 (購于 hvetrogen 公司)連接，得到是 cDNA 質粒，用 ZAP- cDNA Gigapack III Gold Cloning試劑盒(購于Mratagene公司)對cDNA質粒進行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴增，擴增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%的二甲基亞砜(DMSO)，得到含防御素基因的cDNA模板溶液，存于-80°C ；具體包裝、測定和擴增方法依試劑盒說明書進行；4)基因克隆對上述含防御素基因的cDNA模板進行PCR擴增得到PCR產物，PCR擴增的上游引物的核苷酸序列為(正向引物序列5，-GGGTTTGGTTGCCCTGAAGA-3’，反向引物的核苷酸序列為5’ -CTATTCTTGAATAGATCTCC-3’，)PCR產物用膠回收試劑盒(購于上海中科開瑞生物芯片公司)進行回收和純化得到PCR純化產物，將所述PCR純化產物與pMD-18T 載體(購于大連寶生物工程有限公司)連接得到克隆質粒，克隆質粒轉入大腸桿菌T0P10F 感受態細胞(購于北京全氏金生物技術有限公司)中，挑選陽性克隆質粒提取，得到防御素基因Defensin A的克隆質粒；3，端PCR擴增的反應體系和反應條件為10XPCR緩沖液2. 5μ l、25mM的MgCl2 1. Ομ 1、2. 5mM的dNTP 2. O μ 1、10 μ M的所述正向引物溶液1 μ 1、10 μ M的通用引物Τ7溶液 1 μ 1、濃度為5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1，用PCR水定容到 25μ1;反應在ABI Veriti (購于ABI公司)中進行，反應條件為首先94°C預變性5min，然后進入下列循環94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共進行；34個循環，最后72°C 延伸IOmin ;5，端PCR擴增反應體系和反應條件為10XPCR反應緩沖液2. 5 μ l、25mM的 MgCl2溶液1. Ομ 1、2. 5mM的dNTP溶液2.0μ 1、10μΜ的所述反向引物溶液1μ 1、10μΜ的通用引物Τ3溶液1 μ 1、濃度為5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1， 用PCR水定容到25 μ 1，反應在ABI Veriti PCR儀中進行，反應條件為首先94°C預變性5min,然后進入下列循環94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共進行；34個循環，最后 72°C延伸 IOmin ；上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、iTaq DNA聚合酶均購自Promega公司，通用引物T7、通用引物T3購自上海生工科技有限公司。5)重組質粒構建對防御素基因Defensin A的克隆質粒進行擴增反應，擴增反應正向引物為含有Nde I酶切位點的核苷酸序列(5’ -CATATGGGGTTTGGTTGCCCTGAAGA-3’，其中劃線上的序列表示Nde I酶切位點)，反向引物為含Β ο I酶切位點和6個His純化標簽的 5，-CTCGAGCTA jGTGGTGGTGGTGGTGGTG|' TTCTTGAATAGATCTCC-3，，下劃線為 Xho I 酶切
位點，方框為His純化標簽)核苷酸序；將擴增片段純化回收，導入PMD18-T simple (購于大連寶生物工程有限公司)載體，構建亞克隆質粒，轉入大腸桿菌TOPlO感受態細胞(購于北京全式金生物技術有限公司)中，篩選陽性亞克隆質粒，提取陽性亞克隆質粒，用Nde I 和B10 I (均購于NEB公司)雙酶切亞克隆質粒，用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對酶切產生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白的抗菌肽重組基因，測序該抗菌肽重組基因，該抗菌肽重組基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，將該抗菌肽重組基因導入經同樣雙酶切的表達載體pET-21a(購于Novagen公司)，得到重組質粒；重組質粒構建具體依《分子克隆第三版》操作方法擴增反應條件為首先94°C預變性5min，然后進入下列循環94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共進行30個循環，最后72°C 延伸IOmin ；6)防御素Defensin A重組基因表達將上述重組質粒轉入表達宿主菌 BL21 (DE3) -plysS (北京全式金生物技術有限公司)，篩選陽性重組質粒，測序確認，挑取單克隆重組質粒，將單克隆重組質粒接種于200ml LB (上海生工科技有限公司)培養基中， 220rpm，37°C培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7，加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使終濃度達至Ij 0. 6mmol/ml，繼續培養5小時，4°C，5000rpm，離心lOmin，收集菌液；7)重組蛋白純化對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進行洗滌、 溶解、鎳柱親和層析純化。最后對重組蛋白進行透析復性得到具有抗菌活性的重組蛋白，即本發明的菲律賓蛤仔防御素Defensin A，經測序，該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，具體純化方法依蛋白純化試劑盒的說明書操作。實施例
菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因為SEQ ID No. 1中所示的堿基序列。
序列表SEQ ID No. 1為:
caacaggtttagcactcaacggcgaaaatgaggacgatgattgcttttactgtttttatc
cttcttgcagctatgtttttgcaagacgttgatgccgggtttggttgccctgaagatgaa
tatgagtgccacaaccattggtcggttgtaggggcggctattgtgatgcc
gggacattacgtcagaggtgcacttgttacggttgcaaccaaaaagggagatctattcaa
gaatagaactcatcacagcaccaacacgcaatcaagtttctaacaatctacgaactgtct
tattgaactg3.3.3.3. 3. 3. 3.aagaacaattttccaagttattaactccgt
tcttacattaatcttgcaaa
(a)序列特征
長度410bp (有效長度^-246bp)
5
類型堿基序列 鏈型單鏈 拓撲結構線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)(f)特異性名稱cDNA該基因eDNA全長410bp，5，非編碼區長27bp，3，非編碼區長164bp。該防御素基因含有219bp的開放閱讀框，編碼72個氨基酸，其中編碼序列的1-23位氨基酸為信號肽序列，成熟肽為49個氨基酸。實施例2菲律賓蛤仔防御素Defensin A的制備一、用Trizol試劑從感染鰻弧菌的菲律賓蛤仔的血淋巴中提取總RNA，得到總 RNA，提取方法依hvitrogen公司的Trizol試劑說明書進行取菲律賓蛤仔血細胞50ml， 2000g離心lOmin，棄上清，向沉淀細胞中加入20ml的TRIZOL Gnvitrogen)，用高速分散器將細胞分散，室溫下劇烈震蕩IOs ；加入細1氯仿，劇烈震蕩30s ；4°C 10，OOOg高速離心 IOmin ；吸取上清液于一個新離心管中，加入冰浴過的等體積異丙醇(約15ml)，置于_20°C 靜置1小時以上；4°C 10，OOOg高速離心IOmin ；小心棄去上清液；用5ml 70%的乙醇清洗沉淀；4°C 10，OOOg高速離心lOmin，小心棄去上清液；真空干燥5min，用約600 μ 1高純度無RNA酶水溶解RNA，待完全溶解后儲存于-80°C備用。二、用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA，具體純化方法依 QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說明書進行包括在37°C水浴加熱Oligotex Suspension,震蕩混勻，室溫放置；70°C水浴加熱OEB緩沖液；向500 μ 1總RNA溶液(RNA含量約為 2mg)中加入650μ1 OBB 緩沖液，135μ1 of Oligotex Suspension, 650 μ 1 高純度無RNA酶水，70°C加熱體系:3min ；取出反應體系后，室溫下放置lOmin，15，OOOg離心anin， 小心吸走上清液，用600 μ 1 0W2重懸Oligotex-mRNA沉淀，劇烈震蕩。然后將懸濁液移入放在1. 5ml離心管中的離心柱內，15，OOOg離心lmin，將離心柱轉移到一個新的1. 5ml離心管中，加入600 μ 1 0W2，15，000g離心lmin，將進入離心管的液體丟棄，將離心柱轉移到另一新的1. 5ml離心管中；向離心柱中加入50 μ 1已經加熱到70°C的OEB緩沖液，輕輕混勻， 15，OOOg離心Imin ；向離心柱再加入50 μ 1 OEB緩沖液，混勻后15，OOOg離心Imin ；回收離心管中的mRNA溶液約100 μ 1。三、用cDNA合成試劑盒將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，具體操作依試劑盒說明書進行包括雙鏈cDNA末端補平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內切酶酶切等，用QIAEX II膠純化試劑盒對大于IOObp的酶切片段進行回收，回收的酶切片段與 Uni-ZAP XR vector 載體連接，得到 cDNA 質粒，用 ZAP- cDNA Gigapack III Gold Cloning試劑盒對cDNA質粒進行噬菌體包裝、滴度測定和噬菌體文庫擴增，具體方法參照說明書進行，擴增后的文庫加入終濃度為的DMSO溶液，得到cDNA模板溶液，存于_80°C
逆轉錄方法包括一鏈cDNA合成在無RNA酶的200 μ 1離心管中依次加入5X逆轉錄酶緩沖液10 μ 1與2. 5mM的dNTP 8. 5 μ 1，然后加入30 μ 1多聚腺苷酸(poly (A))引物和RNA (5 μ g)，混勻后室溫下放置lOmin，向體系中加入1. 5 μ 1的一鏈合成酶Mratakript RT(50U/l·! 1)，終體積達到50 μ 1，輕輕混勻反應體系，離心數s，42°C溫育1小時。二鏈合成在冰上向含有一鏈cDNA的離心管中加入IOX反應緩沖液10 μ 1，27 μ 1無核酸酶去離子水。然后再向反應體系中加入2μ 1核糖核酸酶H (RNase H) (1. 5U/μ 1)，11 μ 1 DNA聚合酶I (9. OU/ μ 1)，輕輕混勻反應體系，離心數s，16°C放置2. 5小時后立即將反應體系置于冰上。補平cDNA末端向二鏈合成體系中加入需用反應物(IOmM dNTP 6yl，T4DNA聚合酶 2 μ 1與2 μ 1濃度為10mg/ml的BSA)，快速震蕩反應體系離心后，于72°C反應30min ；加入 200μ1酚-氯仿[1 1 (ν/ν)]，震蕩混勻體系，室溫下高速離心aiiin，轉移上清至新的離心管中；加入等體積的氯仿，震蕩混勻，室溫下高速離心anin，然后轉移上清至新管中；加入下列試劑使cDNA沉淀，并震蕩體系20 μ 1 3Μ醋酸鈉，400 μ 1 1無水乙醇，_20°C沉淀過夜；4°C高速離心60min，小心棄去上清，保留沉淀；加入500 μ 1的70 %乙醇輕輕洗滌沉淀， 室溫高速離心anin ；輕輕吸去乙醇，在真空離心機中干燥沉淀；用9μ 1含有EcoR I接頭的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30min。EcoR I接頭的連接向體系中加入下列成分1 μ 1 IOX連接酶緩沖液，1 μ 1 IOmM rATP，1 μ 1 T4DNA連接酶0U/ μ 1)，離心后8°C放置過夜； 700C 30min滅活連接酶。磷酸化EcoR I末端離心反應物k，室溫放置5min冷卻，加入下列反應物用于磷酸化接頭1μ 1 IOX連接酶緩沖液，2 μ 1 IOmM rATP,5y 1滅菌水，2 μ 1 Τ4多聚核苷酸激酶(5U/ μ 1)，37°C溫育30min，70°C 30min滅活激酶，離心2s后室溫放置 5min冷卻。Bio I內切酶酶切向體系中加入下列成分J8 μ 1 Xho I酶切緩沖液，3μ1 Xho Ι(40υ/μ1)，37 溫育1.5小時，加入125μ1的100% (ν/ν)乙醇，_20°C放置過夜，4°C離心60min，棄去上清，完全干燥沉淀，用50 μ 1滅菌雙蒸水溶解沉淀。溶解后的cDNA溶液用 1.0%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離。cDNA片段回收方法從濃度為1. 0%的瓊脂糖凝膠上將大于IOObp的cDNA條帶切下，將大約250mg的膠塊放入1. 5ml離心管中，加入相當于3倍膠塊體積的QXl緩沖液充分混勻，而后向含有膠塊的QXl緩沖液中加入60 μ 1 QIAEX II，劇烈震蕩30s，充分混勻，以 50°C加熱lOmin，溶解膠塊；每^iin震蕩一次，保持溶液始終為黃色；13，OOOrpm離心30s， 小心吸去上清液；用500 μ 1 QXl緩沖液清洗沉淀，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30s并小心吸去上清液；用500 μ 1 PE緩沖液清洗沉淀2次，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30s，棄上清液，真空干燥15min至沉淀變白，加入20 μ 1 ρΗ8. 5的IOmM Tris-Cl溶液室溫下溶解5min。cDNA與Uni-ZAP XR載體Qnvetrogen)連接在另一干凈的200 μ 1離心管中依次加入下列試劑2. 5 μ 1 cDNA懸浮液(> IOOng)，0. 5 μ 1 IOX連接緩沖液，0. 5 μ 1 IOmM rATP (ρΗ7· 5)，1· 0 μ 1 Uni-ZAP XR 載體(1 μ g)，0. 5 μ 1 T4DNA 連接酶(4U/ μ 1)。12°C放置過夜。噬菌體文庫的包裝從-80°C冰箱中取出包裝蛋白，迅速用手握住融化，立即加入 4μ 1重組cDNA，用微量移液器吸頭混勻體系(不要產生氣泡)，離心5s，室溫(22°C )溫育 2小時，加入500 μ 1的SM緩沖液和20 μ 1氯仿，輕輕混勻反應體系。快速離心數s，沉淀蛋白碎片，轉移上清至新管中。包裝反應的滴度測定在含有氨芐青霉素的LB固體培養基(1升培養基含有氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，pH7. 5)上將菌株大腸桿菌XLl-Blue MRF’ 劃線37°C過夜培養；用LB液體培養基(1升培養基含有氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7. 5)培養單克隆菌落，300C，200rpm搖床培養過夜；4°C，IOOOg下離心IOmin沉淀細菌。用25ml IOmM MgSO4重懸細菌；用IOmM MgSO4重懸大腸桿菌XLl-Blue MRF’細胞，使濃度達到0D_ = 0. 5 ；將包裝產物按下列比例與宿主菌混合(1) 1 μ 1包裝產物和200 μ 1 濃度達到 0D_ = 0. 5 大腸桿菌 XLl-Blue MRF’ (OD600 = 0 . 5) ； (2) 0. 1 μ 1 包裝產物和 200 μ 1 濃度達到OD6tltl = 0. 5大腸桿菌XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5)；將混合體系置于37°C溫育 15min使噬菌體充分附著在宿主細胞表面；加入3ml融化狀態下約48°C的NZY上層培養基 (1升培養基含有氯化鈉5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺IOg,酵母提取物5g，瓊脂糖7g，ρΗ7· 5)； 迅速鋪在干燥預熱過的NZY瓊脂培養基(1升培養基含有氯化鈉5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺 10g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，pH7. 5)上，靜置IOmin后，倒置于37°C過夜培養；8小時后可見噬菌斑；分別計數兩個平板的噬菌斑數目，計算其滴度(每毫升生長的噬菌斑數目， pfu/ml)ο30°C 200rpm條件下，用LB液體培養基過夜培養大腸桿菌XLl-Blue MRF，細胞 50ml ； IOOOg離心宿主細胞IOmin ；用25ml IOmM MgSO4重懸細胞，測定600納米可見光下菌液吸光度，然后用IOmM MgSO4將菌液稀釋至濃度為OD6tltl = 0. 5 ；將含有大約5X lOYfu (嗜菌斑形成單位數)噬菌體顆粒的懸濁液與600 μ 1濃度為0D600 = 0. 5的大腸桿菌XLl-Blue MRF'細胞混合，置于Falcon 2059聚丙烯管中，37°C溫育混合液15min，使噬菌體充分附著在宿主菌表面；將混合液加入約48°C的6. 5ml液態NZY上層培養基中，混勻后倒入新鮮的150mm NZY瓊脂糖培養基平板上，靜置平板lOmin，倒轉平板置于37°C約8小時(噬菌斑直徑不超過2mm)；在每塊平板上倒入大約10ml SM緩沖液(1升緩沖液中含有5. 8g NaCl, 2. Og MgSO4 ·7Η20，50. 0ml IM Tris-HCl [ρΗ 7· 5]，5. 0ml 2% [w/v]白明膠)，4°C放置過夜； 將所有平板上的SM緩沖液回收入新的聚丙烯管中，每塊平板再用aiil SM緩沖液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入終濃度為5% (ν/ν)的氯仿，室溫下放置15min，混勻，500g 離心IOmin去除細胞碎片，將上清液轉移至新聚丙烯管中，并重復步驟8、9至上清液澄清， 加入終濃度為&八)01^0，儲存于-801。測定擴增文庫滴度(方法同前)。四、cDNA模板溶液中防御素基因的確認用Exassist Helper Phage和SOLR菌株 (Exassist Helper Phage 和 SOLR 菌株均購于 Mratagene 公司)從 Uni- ZAP XR Vector 上體外切割PBluescript噬菌粒(進行體外切割；然后質粒cDNA的大規模提取和測序分析獲得目的EST序列，對上述EST測序結果，用BLASTn和BLASTx程序分析尋找出防御素基因片段。五、對上述含防御素基因的cDNA模板溶液進行PCR擴增得到PCR產物，PCR 擴增的(正向引物序列5 ’ -GGGTTTGGTTGCCCTGAAGA-3 ’，反向引物的核苷酸序列為 5‘-CTATTCTTGAATAGATCTCC-3‘), PCR產物用膠回收試劑盒進行回收和純化得到PCR純化產物，將所述PCR純化產物與PMD-18T載體連接得到克隆質粒，克隆質粒轉入大腸桿菌T0P10F 感受態細胞中，挑選陽性克隆質粒提取，得到防御素基因Defensin A的克隆質粒；3’端 PCR擴增的反應體系和反應條件為:10XPCR緩沖液2. 5μ l、25mM的MgCl2 1.0μ 1、2. 5mM WdNTP 2. 0μ 1、10μΜ的正向引物1μ 1、10μΜ的通用引物Τ71μ 1、濃度為5υ/μ 1的Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1，cDNA模板(文庫)1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1 ；反應在ABI Veriti PCR儀中進行，反應條件為首先94V預變性5min，然后進入下列循環94V變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共進行34個循環，最后72°C延伸IOmin ；5，端PCR擴增反應體系和反應條件為10XPCR 緩沖液 2. 5 μ l、25mM 的 MgCl2 溶液 1. 0 μ 1、2. 5mM 的 dNTP 溶液 2. 0 μ 1、 10 μ M的反向引物溶液1.0 μ 1、10 μ M的通用引物Τ3溶液1 μ 1、濃度為IU/μ 1的I^aq DNA 聚合酶0.2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1，反應在ABI Veriti PCR 儀中進行，反應條件為首先94°C預變性5min，然后進入下列循環94°C變性30s，60°C退火 30s，72°C延伸60s，共進行34個循環，最后72°C延伸IOmin ；六、對防御素Defensin A基因的克隆質粒再進行擴增反應，(擴增反應正向引物為含有Nde I酶切位點的核苷酸序列5’ -CATATGGGGTTTGGTTGCCCTGAAGA-3’，反向引物為含Xho I酶切位點和6個His純化標簽的核苷酸序列5，-CTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGT TCTTGAATAGATCTCC-3’)；將擴增片段純化回收，導入pMD18_T載體，構建亞克隆質粒，轉入大腸桿菌T0P10F感受態細胞中，篩選陽性亞克隆質粒，提取陽性亞克隆質粒，用Nde I和)(h0 I雙酶切亞克隆質粒，用膠回收純化試劑盒對酶切產生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白的抗菌肽重組基因，測序該抗菌肽重組基因，該抗菌肽重組基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，將該抗菌肽重組基因導入經同樣雙酶切的表達載體pET-21 (a)，得到重組質粒；重組質粒構建具體依《分子克隆第三版》操作方法。擴增反應條件為首先94°C預變性5min，然后進入下列循環94°C變性30s，6(TC退火30s，72°C延伸30s，共進行30個循環，最后72°C延伸IOmin ；七、將上述重組質粒轉入表達宿主菌BL21(DE3)plysS，(購于北京全式金生物技術有限公司)中，篩選陽性重組質粒，測序確認，挑取單克隆重組質粒，將單克隆重組質粒接種于200ml LB液體培養基中，220rpm，37°C培養至OD6tltl = 0. 5-0. 7，加入IPTG，使終濃度達到0. 6mM,繼續培養5h, 4°C，5000rpm,離心IOmin,收集菌液；八、對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進行洗滌、溶解、鎳柱親和層析純化。最后對重組蛋白進行透析復性得到具有抗菌活性的重組蛋白，即本發明的菲律賓蛤仔防御素Defensin A，經測序，該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2 所示；在收集的菌體沉淀中，加入適量的菌體裂解液(0.5M NaCiaOmM Tris-HCl,0. 5% Triton X-IOOpH 8. 5)重懸沉淀，超聲波處理，條件為300W，處理200次，每次k，間隔 15s ；菌體裂解液在4°C下IOOOOrpm離心20min收集包涵體；包涵體沉淀分別用洗液I (0. 5M NaCl, IOmM Tris-HCl, 0. 5 % Triton X_100，2M 尿素 pH 8.5)和洗液 11(0. 5M NaCl, IOmM Tris-HCl, 0. 5% Triton X-100，2%脫氧膽酸鈉pH 8. 5)洗滌一次后用8M尿素溶液(20mM PBS，0.5M NaCl，8M尿素，20mM咪唑pH 7.4)溶解；經鎳柱親和層析純化后的重組蛋白采用逐漸降低尿素濃度的方法進行透析復性，透析緩沖液成分如下100mM Tris-HCl, 50mM NaCl, ImM EDTA，2mM還原型谷胱甘肽，0. 02mM氧化型谷胱甘肽，10%甘油，1 %甘氨酸，尿素 (6M，4M，3M，2M，0M)，pH 8. 5。透析緩沖液依次降低尿素的濃度，每次于4°C透析12小時，最后在TBS緩沖液(50mM Tris-HCl, IOOmM NaCl，pH 8. 5)中透析兩次。重組蛋白濃度測定采用碧云天生物公司的BCA法測定蛋白濃度試劑盒(P0012)。具體操作依試劑盒說明書進行 根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B (50 1)配制適量BCA工作液， 充分混勻；完全溶解蛋白標準品，取10μ 1用PBS稀釋至100μ 1，使終濃度為0. 5mg/ml ；將標準品按0，1,2,4,8,12，16, 20 μ 1加到96孔板的標準品孔中，用PBS溶液補足到20 μ 1 ；加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中并用PBS補足到到20 μ 1 ；各孔加入200 μ 1 BCA工作液，37°C放置30min ；測定A562，根據標準曲線計算出蛋白濃度。菲律賓蛤仔防御素Defensin A編碼蛋白具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，分子量為8035. 17Da，等電點為6. 02，其中編碼序列的1_23位為信號肽序列，成熟肽分子量為 5434. 98Da，等電點為6. 86，有2個凈正電荷。應用例將上述所得菲律賓蛤仔防御素Defensin A加入試管中制成濃度為0. 66mg/mL 抗菌肽液共9管，分別接種巴氏葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌以及副溶血弧菌各5μ 1 Staphylococcus sciuri、
Staphylococcus pasteuri、Vibrio alginolyticus、Enterobacter cloacae、Pseudomonas putida、Proteus mirabilis、Enterobacter aerogenes 以及 Vibrio parahaemolyticus)，
使每管最終菌液濃度約為5X 105CFU/ml，培養M小時后，利用酶標儀測定600nm的光吸收值，確定MIC值，得到如表1所示的結果，從表1中可以看出，菲律賓蛤仔防御素Defensin A 對上述革蘭氏陽性菌(巴氏葡萄球菌和金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌、副溶血弧菌)都有效，說明本發明的菲律賓蛤仔防御素Defensin A是一種廣譜抗菌肽，且療效較好。其中巴氏葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌 37°C培養；溶藻弧菌、惡臭假單胞菌以及副溶血弧菌培養。具體步驟調節各菌至0D_為1后，稀釋1000倍備用。在96孔板中每孔中加入 100 μ 1 LB液體培養基，再在每一行第一個孔中加入100 μ 1抗菌肽，混勻后從第一個孔中吸出100 μ 1加到第二個空中，混勻后吸出100 μ 1加到第三個孔中，依此類推，第10個孔中吸出的100 μ 1不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接種稀釋好的相應菌種5 μ 1，第12 孔為只含培養基的對照。培養Mh以上，測定吸光值，并計算相應MIC。最終測得菲律賓蛤仔防御素Defensin A對以上各種菌都有一定的抑制作用。表1 菲律賓蛤仔防御素Defensin A抗菌素療效表
權利要求
1.一種菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因，其特征在于所述防御素Defensin A基因為序列表SEQ ID NO. 1中堿基序列所示。
2.一種菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因重組蛋白，其特征在于所述防御素 Defensin A基因重組蛋白為序列表SEQ ID NO. 2中氨基酸序列所示。
3.—種權利要求1所述的菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因重組蛋白的應用，其特征在于所述防御素Defensin A基因重組表達產物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。
4.權利要求3所述的菲律賓蛤仔防御素DefensinA基因重組蛋白的應用，其特征在于所述防御素Defensin A基因重組表達產物可作為制備革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的抑菌藥物。
5.權利要求4所述的菲律賓蛤仔防御素DefensinA基因重組蛋白的應用，其特征在于革蘭氏陽性菌為巴氏葡萄球菌或金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌或副溶血弧菌。
全文摘要
本發明涉及抗菌肽，具體涉及一種菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因及其重組蛋白、以及構建方法和應用。所述防御素Defensin A基因為序列表SEQ ID NO.1中堿基序列所示。基因重組蛋白為序列表SEQ ID NO.2中氨基酸序列所示。本發明的防御素Defensin A為菲律賓蛤仔抗菌肽，對受試的多種革蘭氏陽性和陰性病原微生物均具有較強的抑制活性，具有開發為廣譜抗菌類藥物、遺傳選育和飼料添加劑等方面的應用價值。
文檔編號A23L3/3535GK102363783SQ20111032102
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月14日 優先權日2011年10月14日
發明者吳惠豐, 張林寶, 王清, 趙建民 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所