專利名稱：一種利用發根農桿菌誘導產生雷公藤毛狀根的方法
技術領域：
本發明公開了一種利用發根農桿菌誘導產生雷公藤(Tripterygium wilfordii Hok . Π)毛狀根的方法，并初步建立了雷公藤毛狀根離體培養體系。
背景技術：
發根農桿菌(Agrobaeterium rhizogenes)是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)農桿菌屬(Agrobactefium) —類革蘭氏陰性土壤農桿菌，可以侵染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物，通過發根農桿菌感染植物，將其所含的Ri質粒上的一段DNA (T-DNA)轉移并整合到植物基因組中，誘導產生毛狀根。雷公藤是一種雙子葉木質藤本植物，分布于南方福建、江西、浙江、廣東、湖南、湖北、臺灣等省份。是珍貴的藥用植物。雷公藤提取物中含有70種以上的有效成分，主要有； 生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類等次生代謝物。這些成分具有解毒散結、活血化瘀、消炎、抗腫瘤、免疫調整、抗生育等多種藥理作用。廣泛用于治療類風濕性關節炎、肺病、腎病、 皮膚病、白血病等疾病。由于植物次生代謝物質具有極其復雜的化學結構，至今仍沒有找到有效的或經濟可行合成方法。雖然近幾十年來利用植物細胞培養技術生產次生代謝產物的研究獲得了迅速發展，但是由于植物細胞培養是采用未分化的細胞，其生長與代謝通路常常不相容的，因而次生代謝產物的生產能力低且不穩定，從而限制了其產業化的發展。而經過發根農桿菌侵染植物所形成的毛狀根(hair root)由于其生長迅速且遺傳性狀穩定，成為藥用植物次生代謝產物生產的重要原料。毛狀根本質是一種惡性增殖的器官、相對于常規細胞培養，其具有激素自養、生長迅速、周期短等特點，因而可進行大量培養。同時它起源于單細胞，遺傳性狀穩定，擁有親本植株的特征次生代謝途徑。利用藥用植物毛狀根培養體系生產次生代謝產物的研究已有幾十年的歷史。如 Mano等(1986)建立了 29個日本莨菪japinlica)毛狀根無性系，研究表明均能產生阿托品烷生物堿，從中選育出的克隆，其重量的增加比正常植株高出102倍，莨菪堿含量高達1. 3%，為原植株根中的3倍；Yshikawa和Furuya (1987)通過人參的愈傷組織成功誘導出了毛狀根，這種毛狀根在無外源激素的條件下生長迅速，是用激素誘導人參根快速增長的2倍，毛狀根中有效成分人參皂甙的含量最高可達干重的0. 95%，高于在生根和天然栽培根的含量，Parr等(1988)通過誘導長春花形成的毛狀根，并從中檢測到了具有抗癌作用的長春堿，但通過長春花的細胞培養卻無法得到這種生物堿，說明毛狀根能夠合成某些懸浮細胞不能合成的次生代謝物質。
目前國內外尚未見有關利用雷公藤毛狀根對其活性物質進行生產的報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用發根農桿菌誘導產生雷公藤毛狀根的方法，利用毛狀根培養生產雷公藤甲素，可用以填補中藥缺口。
本發明的方法包括(1)無菌外植體的獲得；(2)發根農桿菌菌液的制備；(3)農桿菌侵染誘導毛狀根；(4)毛狀根離體培養體系的建立，所述毛狀根離體培養體系的建立，是在27士 1°C暗培養條件下，將毛狀根置于含500mg/L頭孢噻肟鈉的1 / 2MS固體培養基中大量培養，每7d繼代一次，繼代過程中逐漸降低頭孢噻肟鈉的使用濃度，直至無菌，最后將已完全無菌的毛狀根于1 / 2MS固體培養基上進行繼代培養保存。 發根農桿菌菌液的制備如下發根農桿菌活化后接種于含100mg/L卡那霉素的液體YEB培養基中，27 士 1°C黑暗條件下120-180r/min振蕩培養至OD6tltl=O. 5-0. 8，收集菌液， 并將菌體在4°C條件下，SOOOr/min離心10分鐘，棄上清液，將菌體重懸于2倍體積的無菌 1 / 2MS液體培養基中。農桿菌浸染誘導毛狀根的方法為將無菌外植體與發根農桿菌菌液共同培養于 1 / 2MS液體培養基內，加入識別信號因子乙酰丁香酮至150ymol/L，以促進其轉化，在 120r/min, 27士 1°C下振蕩處理30min后，取出浸染的外植體用無菌濾紙吸干，在27士 1°C 暗培養條件下，置于1 / 2MS固體培養基中誘導毛狀根產生。對產生的無菌雷公藤毛狀根進行檢測時發現其含有相當數量的雷公藤甲素 (15. 6559mg/g),明顯高于傳統雷公藤野生根及組培根中甲素的含量，具有良好的工業化應用前景。
圖1為誘導產生的毛狀根。圖2為雷公藤標準品液相色譜檢測圖。圖3為誘導產生的毛狀根中雷公藤甲素含量的液相色譜檢測圖。
具體實施例方式本發明的一種利用發根農桿菌誘導產生雷公藤毛狀根的方法，具體內容與實施方式如下
1、雷公藤無菌外植體的獲取摘取野生雷公藤幼苗的葉片和嫩莖，清水沖洗后，超凈工作臺上切段，劃痕。葉片切成lcm2，嫩莖長2 4 cm。嫩莖劃痕2 3次，并保持兩端剪口平滑。將切段外植體經70%的酒精消毒lmin，無菌水清洗3次后，再浸泡于0. 1% HgCl2 溶液中消毒IOmin后，用無菌水沖洗3次后，無菌濾紙擦干表面水分，置于1 / 2MS液體培養基，在20001x，16h/d日光照，25 °C條件下培養2 3d，以使創傷部位分泌更多的酚類物質，提高轉化率。2、發根農桿菌菌液的制備方法將實驗室保藏的發根農桿菌GIM1. 141 (購于廣東微生物研究所菌種保藏中心)活化后接種于含100mg/L卡那霉素的液體YEB培養基(牛肉浸膏，5g/L ；酵母浸膏，1 g/L ；蛋白胨，5g/L ；硫酸鎂，0. 5g/L ；pH=7. 0-7. 4)中，27士 1°C黑暗條件下振蕩培養(120-180r/min)至OD6tltl ^ 0. 5-0. 8收集菌液，并將菌體在4°C條件下，SOOOr/ min離心10分鐘，棄上清液，將菌體重懸于2倍體積的無菌1 / 2MS液體培養基中。3、農桿菌浸染誘導毛狀根的方法將經過預培養的雷公藤無菌外植體，放入制備好的農桿菌重懸菌液中，加入識別信號因子乙酰丁香酮(acetosyringone)至150μπιΟ1/1， 以促進其轉化，在120r/min，(27士 1) °C下振蕩處理30min后，取出浸染的外植體用無菌濾紙吸干，在(27士 1)°C暗培養條件下，置于1 / 2MS固體培養基中誘導毛狀根產生，每7d繼代一次，約30d后在外植體的創傷部位可見有毛狀根長出。4 、雷公藤毛狀根離體培養體系建立將生成的毛狀根從雷公藤外植體上切下， 在(27士 1)°C暗培養條件下，置于含500mg/L頭孢噻肟鈉的1 / 2MS固體培養基中生長，每 7d繼代一次，繼代過程中逐漸降低頭孢噻肟鈉的使用濃度，直至無菌。最后將已完全無菌的雷公藤毛狀根于1 / 2MS固體培養基上進行繼代培養保存。為了進一步說明本發明的效果，進行了以下有益的試驗
1、不同類型外植體對發根的影響。采用發根農桿菌GIM1.141對雷公藤的嫩莖與葉片外植體進行誘導發根，結果如表1所示。由表1可知，發根農桿菌GIM1. 141菌株對雷公藤葉片外植體誘導產生毛狀根的效率明顯高于嫩莖外植體。表1不同外植體產生毛狀根的發根率
權利要求
1.一種利用發根農桿菌誘導產生雷公藤毛狀根的方法，包括(1)無菌外植體的獲得； (2)發根農桿菌菌液的制備；(3)農桿菌侵染誘導毛狀根；(4)毛狀根離體培養體系的建立， 其特征在于所述毛狀根離體培養體系的建立，是在27士 1°C暗培養條件下，將毛狀根置于含500mg/L頭孢噻肟鈉的1 / 2MS固體培養基中大量培養，每7d繼代一次，繼代過程中逐漸降低頭孢噻肟鈉的使用濃度，直至無菌，最后將已完全無菌的毛狀根于1 / 2MS固體培養基上進行繼代培養保存。
2.根據權利要求1所述利用發根農桿菌誘導產生雷公藤毛狀根的方法，其特征在于 發根農桿菌菌液的制備如下發根農桿菌活化后接種于含100mg/L卡那霉素的液體YEB培養基中，27 士 1°C黑暗條件下120-180r/min振蕩培養至OD6tltl=O. 5-0. 8，收集菌液，并將菌體在4°C條件下，8000r/min離心10分鐘，棄上清液，將菌體重懸于2倍體積的無菌1 / 2MS 液體培養基中。
3.根據權利要求1所述利用發根農桿菌誘導產生雷公藤毛狀根的方法，其特征在于 農桿菌浸染誘導毛狀根的方法為將無菌外植體與發根農桿菌菌液共同培養于1 / 2MS液體培養基內，加入識別信號因子乙酰丁香酮至150ymol/L，以促進其轉化，在120r/min， 27士 1°C下振蕩處理30min后，取出浸染的外植體用無菌濾紙吸干，在27士 1°C暗培養條件下，置于1 / 2MS固體培養基中誘導毛狀根產生。
全文摘要
本發明提供了一種利用發根農桿菌誘導產生雷公藤毛狀根的方法，包括(1)無菌外植體的獲得；(2)發根農桿菌菌液的制備；(3)農桿菌侵染誘導毛狀根；(4)毛狀根離體培養體系的建立，所述毛狀根離體培養體系的建立，是在27±1℃暗培養條件下，將毛狀根置于含500mg/L頭孢噻肟鈉的1∕2MS固體培養基中大量培養，每7d繼代一次，繼代過程中逐漸降低頭孢噻肟鈉的使用濃度，直至無菌，最后將已完全無菌的毛狀根于1∕2MS固體培養基上進行繼代培養保存。對產生的無菌雷公藤毛狀根進行檢測時發現其含有相當數量的雷公藤甲素，明顯高于傳統雷公藤野生根及組培根中甲素的含量，具有良好的工業化應用前景。利用毛狀根培養生產雷公藤甲素，可用以填補中藥缺口。
文檔編號C12N15/82GK102321664SQ20111032091
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者吳承禎, 宋萍, 封磊, 洪偉, 陳敏捷 申請人:福建農林大學