專利名稱：利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法。
背景技術：
白蟻Termite屬于節肢動物門昆蟲綱有翅亞綱等翅目的昆蟲，是較為古老的社會性害蟲，Termite屬于典型的寡氮營養型生物，其腸道固氮微生物的固氮作用是白蟻體內氮素的主要來源。每年因白蟻危害建筑物和農作物所造成的經濟損失達千億美元以上。現有的殺滅白蟻的藥劑均為化學藥劑，故都有很大的毒副作用，造成嚴重的環境污染及人體危害。利用生物技術開發具有高效、無毒、殘效期長、對環境影響小的白蟻生物防治劑成為未來白蟻防治劑的主要方向。
發明內容
本發明是要解決現有利用化學藥劑殺滅白蟻的方法毒副作用大，造成嚴重的環境污染及人體危害的問題，提供利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法。本發明利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，按以下步驟進行一、將樹木內生菌挑取一環，接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，在37°C、180r/min條件下培養2 3d，得到樹木內生菌的培養液；將樹木內生菌的培養液以5000r/min離心 10 15min，取上清液，在無菌、35°C恒溫水浴、150r/min的條件下濃縮至其體積的二十分之一，即得到樹木內生菌發酵液；二、制備素瓊脂平板向IOOOmL水中加20g的瓊脂，滅菌得素瓊脂，然后向每個平板倒10 15mL的素瓊脂，得素瓊脂平板，將牛津杯立在素瓊脂平板上；三、菌懸液的制備挑取一環白蟻腸道固氮菌，接種到無氮斜面培養基上，于37°C培養12 Mh，得白蟻腸道固氮菌斜面；取5mL無菌水，加到白蟻腸道固氮菌斜面上，用接種環在斜面上刮擦，再用無菌移液管吸打混勻，稀釋至10_3，得菌懸液；四、半固體培養基的制備向無氮液體培養基中加入瓊脂，使瓊脂的質量濃度為0. 75%，加熱至瓊脂溶化，得到無氮半固體培養基；五、取20mL步驟四制備的無氮半固體培養基，待冷卻至40 60°C時加入2mL步驟三制備的菌懸液，混勻，倒入步驟二得到的插有牛津杯的素瓊脂平板上，待培養基凝固后拔出牛津杯，用移液槍向小孔中加入100 μ L步驟一得到的樹木內生菌發酵液，在 4°C冰箱中放置過夜，然后在30°C培養箱中培養16 Mh，觀察并用游標卡尺測定抑菌圈直徑，即完成。本發明步驟一所述樹木內生菌為枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-004、枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47或羅森檜沙雷氏菌HUB-I-107 ；其中枯草芽孢桿菌新亞種(Bacillus subtilis subsp. Iawsoniana subsp. nov)HUB-I_004 保藏在中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC No :M 209161 ；枯草芽孢桿菌新亞禾中(Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov) HUB-I-047保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC No =M 209162 ；羅森檜沙雷氏菌(Serratialawsoniana sp. nov)HUB-I-107保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC No :M209163。本發明步驟三所述白蟻腸道固氮菌為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-004、變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006 或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033 ；其中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2011年9月15日， 保藏編號為 CCTCC No :M2011312 ；變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005 保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2011 年9月15日，保藏編號為CCTCC No =M 2011313 ；產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HUB-IV-006保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2011年9月15日，保藏編號為CCTCC No =M 2011314 ；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2011年9月15日，保藏編號為CCTCC No :M2011315。有益效果本發明方法中樹木內生菌代謝產物對白蟻腸道固氮菌有較好的抑制作用，對白蟻腸道固氮菌有較好抑制作用的樹木內生菌生物發酵合成的代謝產物對白蟻也有較好的殺滅作用。本發明為利用生物技術開發具有高效、無毒、殘效期長、對環境影響小的白蟻生物防治劑提供了一種簡潔而可行的新的途徑，并可完善化學藥劑防治存在著低效、高毒劑殘留，威脅人類健康和破壞環境等問題。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，按以下步驟進行一、將樹木內生菌挑取一環，接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，在37°C、180r/min條件下培養2 3d，得到樹木內生菌的培養液；將樹木內生菌的培養液以5000r/min離心 10 15min，取上清液，在無菌、35°C恒溫水浴、150r/min的條件下濃縮至其體積的二十分之一，即得到樹木內生菌發酵液；二、制備素瓊脂平板向IOOOmL水中加20g的瓊脂，滅菌得素瓊脂，然后向每個平板倒10 15mL的素瓊脂，得素瓊脂平板，將牛津杯立在素瓊脂平板上；三、菌懸液的制備挑取一環白蟻腸道固氮菌，接種到無氮斜面培養基上，于37°C培養12 Mh，得白蟻腸道固氮菌斜面；取5mL無菌水，加到白蟻腸道固氮菌斜面上，用接種環在斜面上刮擦，再用無菌移液管吸打混勻，稀釋至10_3，得菌懸液；四、半固體培養基的制備向無氮液體培養基中加入瓊脂，使瓊脂的質量濃度為0. 75%，加熱至瓊脂溶化，得到無氮半固體培養基；五、取20mL步驟四制備的無氮半固體培養基，待冷卻至40 60°C時加入2mL步驟三制備的菌懸液，混勻，倒入步驟二得到的插有牛津杯的素瓊脂平板上，待培養基凝固后拔出牛津杯，用移液槍向小孔中加入IOOyL步驟一得到的樹木內生菌發酵液，在 4°C冰箱中放置過夜，然后在30°C培養箱中培養16 Mh，觀察并用游標卡尺測定抑菌圈直徑，即完成。本實施方式步驟一所述樹木內生菌為枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-004、枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47或羅森檜沙雷氏菌HUB-I-107 ；其中枯草芽孢桿菌新亞種(Bacillus subtilis subsp. Iawsoniana subsp. nov)HUB-I_004 保藏在中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC No :M 209161 ；枯草芽孢桿菌新亞禾中(Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov) HUB-I-047保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC No =M 209162 ；羅森檜沙雷氏菌(Serratia lawsoniana sp. nov)HUB-I-107保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC No :M209163。本實施方式步驟三所述白蟻腸道固氮菌為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004、變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006 或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033 ；其中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2011年9月15日， 保藏編號為 CCTCC No :M2011312 ；變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005 保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2011 年9月15日，保藏編號為CCTCC No =M 2011313 ；產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HUB-IV-006保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2011年9月15日，保藏編號為CCTCC No =M 2011314 ；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2011年9月15日，保藏編號為CCTCC No :M2011315。本實施方式樹木內生菌發酵液對白蟻腸道固氮菌的抑菌圈大小(mm)如表1所示， 結果表明樹木內生菌的發酵產物對白蟻腸道固氮菌株均有較好的抑制作用。表1樹木內生菌發酵液對白蟻腸道固氮菌的抑菌圈大小(mm)
菌株HUB-IV-004HUB-IV-005HUB-IV-006HUB-IV-033HUB-1-00422. 1±1. 3122. 3±1. 5419. 2±1. 3220. 1±2. 76HUB-I-10720. 5±1. 2619. 2±0. 8717. 1±1. 6718. 5±0. 79HUB-I-4717. 1±1. 3517. 2±0. 9315. 1±1. 0512. 6±1. 1具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三所述無氮斜面培養基由 15g 蔗糖、0. 8g KH2P04、0. 2g MgS04、0.2g NaClUg CaC03、20g 瓊脂、ImL 質量濃度為 10 % 的 Na2MO4 溶液、ImL 的 H3BO3 溶液、ImL 的 MnSO4 溶液、ImL 的!^e2SO4 溶液和 IOOOmL H2O 組成，調PH至6. 5 7.0，于121°C滅菌30min。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟四所述無氮液體培養基由 15g 蔗糖、0. 8g KH2P04、0.2g MgS04、0· 2g NaClUg CaC03、ImL 質量濃度為 10 % 的 Na2MO4 溶液、ImL 的 H3BO3 溶液、ImL 的 MnSO4 溶液、ImL 的 Fe2SO4 溶液和 IOOOmL H2O組成，調pH至6. 5 7. 0，于121°C滅菌30min。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟三中于 37°C培養15 20h。其它與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟三中于 37°C培養18h。其它與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟五中在 30°C培養箱中培養18 22h。其它與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟五中在 30°C培養箱中培養20h。其它與具體實施方式
一至五之一相同。
權利要求
1.利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，其特征在于利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，按以下步驟進行一、將樹木內生菌挑取一環，接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，在37°C、180r/min條件下培養2 3d，得到樹木內生菌的培養液；將樹木內生菌的培養液以5000r/min離心10 15min，取上清液，在無菌、35°C恒溫水浴、150r/min的條件下濃縮至其體積的二十分之一， 即得到樹木內生菌發酵液；二、制備素瓊脂平板向IOOOmL水中加20g的瓊脂，滅菌得素瓊脂，然后向每個平板倒10 15mL的素瓊脂，得素瓊脂平板，將牛津杯立在素瓊脂平板上； 三、菌懸液的制備挑取一環白蟻腸道固氮菌，接種到無氮斜面培養基上，于37°C培養12 Mh，得白蟻腸道固氮菌斜面；取5mL無菌水，加到白蟻腸道固氮菌斜面上，用接種環在斜面上刮擦，再用無菌移液管吸打混勻，稀釋至10_3，得菌懸液；四、半固體培養基的制備向無氮液體培養基中加入瓊脂，使瓊脂的質量濃度為0. 75%，加熱至瓊脂溶化，得到無氮半固體培養基；五、取20mL步驟四制備的無氮半固體培養基，待冷卻至40 60°C時加入2mL步驟三制備的菌懸液，混勻，倒入步驟二得到的插有牛津杯的素瓊脂平板上，待培養基凝固后拔出牛津杯，用移液槍向小孔中加入100 μ L步驟一得到的樹木內生菌發酵液，在4°C冰箱中放置過夜，然后在30°C培養箱中培養16 Mh，觀察并用游標卡尺測定抑菌圈直徑，即完成。
2.根據權利要求1所述的利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，其特征在于步驟三所述無氮斜面培養基由15g蔗糖、0. 8g KH2P04、0. 2g MgS04、0.2g NaCl、 IgCaCO3,20g瓊脂、ImL質量濃度為10 %的Na2MO4溶液、ImL的H3BO3溶液、ImL的MnSO4溶液、 ImL 的 Fe2SO4 溶液和 IOOOmL H2O 組成，調 pH 至 6. 5 7. 0，于 121°C滅菌 30min。
3.根據權利要求1或2所述的利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法， 其特征在于步驟四所述無氮液體培養基由15g蔗糖、0.8g KH2P04、0.2g MgS04、0. 2g NaCl, Ig CaCO3, ImL質量濃度為10 %的Na2MO4溶液、ImL的H3BO3溶液、ImL的MnSO4溶液、ImL的 Fe2SO4 溶液和 IOOOmL H2O 組成，調 pH 至 6. 5 7. 0，于 121°C滅菌 30min。
4.根據權利要求3所述的利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，其特征在于步驟三中于37°C培養15 20h。
5.根據權利要求3所述的利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，其特征在于步驟三中于37°C培養18h。
6.根據權利要求4所述的利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，其特征在于步驟五中在30°C培養箱中培養18 22h。
7.根據權利要求4所述的利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，其特征在于步驟五中在30°C培養箱中培養20h。
全文摘要
利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法，涉及一種利用樹木內生菌代謝產物抑制白蟻腸道固氮菌的方法。是要解決現有利用化學藥劑殺滅白蟻的方法毒副作用大，造成嚴重的環境污染及人體危害的問題。方法一、樹木內生菌發酵液的制備；二、制備素瓊脂平板；三、菌懸液的制備；四、半固體培養基的制備；五、取無氮半固體培養基，待冷卻至50℃時加入菌懸液，混勻，倒入插有牛津杯的素瓊脂平板上，待培養基凝固后拔出牛津杯，用移液槍向小孔中加入樹木內生菌發酵液，在4℃冰箱中放置過夜，然后在30℃培養箱中培養16h，觀察并用游標卡尺測定抑菌圈直徑，即完成。本發明方法中樹木內生菌代謝產物對白蟻腸道固氮菌有較好的抑制作用。
文檔編號C12R1/065GK102392071SQ20111031894
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者周東坡, 張小燕, 趙凱 申請人:黑龍江大學