專利名稱：一種高密度高產脂率培養產油微藻的方法
技術領域：
本發明屬于單細胞油脂及生物柴油生產技術領域，特別涉及一種同步式提高產油微藻的生物量和產脂量的方法。
背景技術：
產油微藻資源豐富，能在多種培養條件下生長，光合作用效率高，生物量高，生長繁殖快，生長周期短，自身合成油脂的能力強，因而被許多學者認為是制備單細胞油脂及生物柴油的最佳原料之一。微藻油脂通過與低碳醇進行轉酯化反應可生產生物柴油，利用微藻生產生物柴油，對緩解人類面臨的能源短缺和環境污染有著巨大的潛力，同時對減少生產生活中對化石能源的依賴、保證國家能源安全具有深遠意義。微藻油脂通過與多碳醇進行酯交換反應，可用于生產可生物降解的潤滑油、溶劑油、油漆和油墨溶劑、表面活性劑、粘接劑等產品，高值化潛力大。部分微藻油脂含有多不飽和脂肪酸，是生產具有高附加值單細胞油脂的重要原料。然而利用微藻生產單細胞油脂及生物柴油存在一個較大的問題就是在培養過程中，藻細胞生長與產脂不同步。藻體增殖與油脂合成間存在著競爭關系，一般產脂微藻在正常的生長環境條件下，細胞內累積較少的脂類。在不利于生長繁殖的環境條件下，才進入產油模式，細胞內累積較多的脂類和其他抗逆活性物質，以維持種群生存。為了解決這些問題，實現藻細胞生長模式與產油模式的可控調變，已經使用了養料分批供應培養技術或更換培養基組合物的方法。然而，這些技術和方法仍有局限性，控制錯綜復雜的營養供應非常麻煩而且容易出錯
發明內容
本發明目的在于提供一種操作簡單的同步式提高產油微藻生物量和產脂量的方法。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為取對數生長期的產油微藻，培養至添加有碳源和/或氮源的無菌添加液的液體培養基中，在溫度為18-35°C，轉速為100-200rpm，光照強度為0-150μπιΟ1 πΓΥ1連續光照的搖床中振蕩培養6-40天，直至藻液中其他營養元素如磷、硫、鎂等耗盡(取培養液采用離子色譜法測定營養元素殘留量)，培養結束；其中，添加有碳源和/或氮源的添加液的液體培養基中培養過程中再次添加無菌添加液。所述再次添加無菌添加液時添加碳源和氮源的添加液或碳源添加液兩種模式，兩種添加模式交替進行，直至培養至再添加碳、氮源對提高生物量和產脂量效果已不明顯時結束添加。所述每種添加模式的間隔為2-5天。所述碳源為無機碳源和或有機碳源；所述無機碳源為二氧化碳、碳酸鹽和/或碳酸氫鹽；有機碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇和/或醋酸鹽。所述氮源為無機氮源和/或有機氮源；其中無機氮源為硝酸鹽、銨鹽和/或氨水；機氮源為尿素、酵母粉和/或蛋白胨。所述產油微藻為脂含量達到細胞干重8%以上的可培養微藻株系。本發明原理是藻體增殖與油脂合成間存在著競爭關系，一般產脂微藻是在生長培養基中氮素耗盡并且有過量碳素用于脂類合成時，才能在細胞內累積較多的脂類。需要在適當的生長期切斷營養物質氮的供應，這樣就能控制藻類進入產油模式。不過，這也同時減緩了藻細胞的生長，甚至導致死亡，需要在適當的產脂期恢復營業物質氮的供應，只要找準這個量，控制藻株處于間歇式氮缺乏和持續碳素供應狀態，就可實現產油微藻的生長與產脂同步進行。本發明所具有的優點本發明將產油微藻的生長過程和產脂過程通過交替、循環的控制模式進行技術集成，既能提高藻細胞濃度，同時又能高效產脂，與現有技術相比，本發明提供的方法操作簡單可行，無需更換培養基組合物，無需全營養養料分批供應，無需實時計算調整養料流加速率,添加液成本低廉制備簡單,從而大大地降低了生產成本。
圖1是本發明實施例所提供的本發明技術方案流程示意圖。本發明目的、功能及優點將結合實施例，參照附圖做進一步說明。
具體實施例方式
如圖1所示，本發明實施例提供的技術方案流程示意圖。具體而言，本發明提供了一種培養產油微藻的方法，其特征在于以簡單易操作的流程實現同步式提高產油微藻生物量和產脂量，包括以下步驟(I)選取合適的碳源和氮源，分別制成添加液，高壓蒸汽滅菌或過濾滅菌；碳源既包括無機碳源如二氧化碳、碳酸鹽和/或碳酸氫鹽，也包括有機碳源如葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇和/或醋酸鹽。氮源既包括無機氮源如硝酸鹽、銨鹽和/或氨水，也包括有機氮源如尿素、酵母粉和/或蛋白胨。(2)取產油微藻在液體培養基中培養，通過向藻液中加入步驟(I)所述的碳添加液和氮添加液，控制藻細胞進入生長模式；通過向藻液中加入步驟(I)所述的碳添加液，控制藻細胞進入產油模式；所述的向藻液中加入碳、氮添加液，添加方式是一次性添加；添加間隔以2-5天為宜，添加量以加入的碳源和氮源在添加間隔期間能夠被藻細胞完全消耗為宜，添加次數以藻細胞的碳、氮實際總需量除以每次的添加量換算而得。(3)步驟(2)所述的兩種添加模式交替進行，直至藻液中其他營養元素如磷、硫、鎂等耗盡，培養結束，采收藻細胞破壁提脂。此時可同時獲得最大生物量和最大產脂量。所述的至藻液中其他營養元素如磷、硫、鎂等耗盡時培養結束，是指再添加碳、氮源對提高生物量和產脂量效果已不明顯，在藻細胞密度達到最高且培養液內外加碳源被完全消耗時結束培養。實施例1(I)選取葡萄糖作為碳源，硝酸鉀作為氮源，配制成高濃度的無菌添加液。(2)取產油微藻小球藻(Chlorella kessleri)在液體培養基中暗異養培養，培養基為Kuhl培養基,配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、O. 012mg/L四水鑰酸銨，pH 6. 5。藻種按10% (體積比)接種量，接種到含IOOml無菌Kuhl培養基的250ml三角瓶中，在溫度為25 □ C，連續黑暗，轉速為150rpm的搖床中振蕩培養。(3)培養4天后，在無菌條件下，向培養液內加入葡萄糖至終濃度20g/L，繼續培養5天后，向培養液內加入葡萄糖至終濃度20g/L，硝酸鉀至終濃度為lg/L，再繼續培養5天后，培養結束，取樣測定生物量和產脂量。生物量采用干重法測定(取5ml藻懸液于室溫3000rpm離心5min,棄去上清液。藻細胞沉淀用蒸懼水洗2次,然后過濾到Whatman GF/C濾紙上，置80°C烘箱內烘至恒重后稱重)，測得生物量濃度高達18g/L ;脂含量通過氣相色譜(GC)測定(色譜條件為DB-23毛細管氣相色譜柱30mX0. 25mmX0. 25 μ m ;氮氣為載氣；采用分流模式，進樣體積為I μ I ;進樣口溫度為250°C ；FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 50C /min的升溫速率從140°C升至240°C )，測定脂含量高達細胞干重的48%。實施例2(I)選取葡萄糖作為碳源，硝酸鉀作為氮源，配制成高濃度的無菌添加液。(2)取產油微藻小球藻(Chlorella kessleri)在液體培養基中光異養培養，培養基為Kuhl培養基,配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、O. 012mg/L四水鑰酸銨，pH 6. 5。藻種按10%接種量，接種到含IOOml無菌Kuhl培養基的250ml三角瓶中，在溫度為25 □ C,轉速為150rpm,光照強度為100 μ mo I m_2s_1連續光照的搖床中振蕩培養。(3)培養2天后 ，在無菌條件下，向培養液內加入葡萄糖至終濃度10g/L，繼續培養2天后，向培養液內加入葡萄糖至終濃度10g/L，硝酸鉀至終濃度為O. 5g/L，再繼續培養3天后，向培養液內加入葡萄糖至終濃度10g/L，繼續培養3天后，向培養液內加入葡萄糖至終濃度10g/L，硝酸鉀至終濃度為0. 5g/L，繼續培養4天后，培養結束，取樣測定生物量和產脂量。生物量采用干重法測定(取5ml藻懸液于室溫3000rpm離心5min,棄去上清液。藻細胞沉淀用蒸懼水洗2次,然后過濾到Whatman GF/C濾紙上,置80°C烘箱內烘至恒重后稱重)，測得生物量濃度高達19g/L ;脂含量通過氣相色譜(GC)測定(色譜條件為DB-23毛細管氣相色譜柱30mX0. 25mmX0. 25 μ m ;氮氣為載氣；采用分流模式，進樣體積為I μ I ;進樣口溫度為250°C ;FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 5°C /min的升溫速率從140°C升至240°C )，測定脂含量高達細胞干重的47%。實施例3(I)選取蔗糖作為碳源，尿素作為氮源，配制成高濃度的無菌添加液。(2)取產油微藻小球藻(Chlorella zofingiensis)在液體培養基中光異養培養，培養基為Kuhl培養基,配方10g/L鹿糖、0. 3g/L尿素、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、0. 29mg/L七水硫酸鋅、0. 17mg/L 一水硫酸錳、0. 06mg/L硼酸、0. 002mg/L五水硫酸銅、0. 012mg/L四水鑰酸銨，pH 6. 5。藻種按10%接種量，接種到含IOOml無菌Kuhl培養基的250ml三角瓶中，在溫度為25°C，轉速為150rpm，光照強度為IOOymol πΓΥ1連續光照的搖床中振蕩培養。(3)培養4天后，在無菌條件下，向培養液內加入蔗糖至終濃度10g/L，繼續培養4天后，向培養液內加入蔗糖至終濃度10g/L，尿素至終濃度為O. 3g/L，再繼續培養4天后，培養結束，取樣測定生物量和產脂量。生物量采用干重法測定(取5ml藻懸液于室溫3000rpm離心5min,棄去上清液。藻細胞沉淀用蒸懼水洗2次,然后過濾到Whatman GF/C濾紙上,置80°C烘箱內烘至恒重后稱重)，測得生物量濃度高達15g/L;脂含量通過氣相色譜(GC)測定(色譜條件為DB-23毛細管氣相色譜柱30mX0. 25mmX0. 25 μ m;氮氣為載氣；采用分流模式，進樣體積為1μ I ;進樣口溫度為250°C ;FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 50C /min的升溫速率從140°C升至240°C )，測定脂含量高達細胞干重的47%。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或 改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種高密度高產脂率培養產油微藻的方法，其特征在于取對數生長期的產油微藻，培養至添加有碳源和/或氮源的無菌添加液的液體培養基中，在溫度為18-35°C，轉速為100-200rpm,光照強度為0-150 u mo I m_2s_1連續光照的搖床中振蕩培養6_40天。
其中，添加有碳源和/或氮源的添加液的液體培養基中培養過程中再次添加無菌添加液。
2.按權利要求1所述的高密度高產脂率培養產油微藻的方法，其特征在于所述再次添加無菌添加液時添加碳源和氮源的添加液或碳源添加液兩種模式，兩種添加模式交替進行。
3.按權利要求2所述的高密度高產脂率培養產油微藻的方法，其特征在于所述每種添加模式的間隔為2-5天。
4.按權利要求1所述的高密度高產脂率培養產油微藻的方法，其特征在于所述碳源為無機碳源和或有機碳源；所述無機碳源為二氧化碳、碳酸鹽和/或碳酸氫鹽；有機碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇和/或醋酸鹽。
5.按權利要求1所述的高密度高產脂率培養產油微藻的方法，其特征在于所述氮源為無機氮源和/或有機氮源；其中無機氮源為硝酸鹽、銨鹽和/或氨水；機氮源為尿素、酵母粉和/或蛋白胨。
全文摘要
本發明屬于單細胞油脂及生物柴油生產技術領域，特別涉及一種同步式提高產油微藻的生物量和產脂量的方法。取對數生長期的產油微藻，培養至添加有碳源和/或氮源的無菌添加液的液體培養基中，在溫度為18-35℃，轉速為100-200rpm，光照強度為0-150μmol m-2s-1連續光照的搖床中振蕩培養6-40天。其中，添加有碳源和/或氮源的添加液的液體培養基中培養過程中再次添加無菌添加液。本發明將產油微藻的生長過程和產脂過程通過交替、循環的控制模式進行技術集成，既能提高藻細胞濃度，同時又能高效產脂，一舉兩得。無需更換培養基組合物，無需全營養養料分批供應，無需實時計算調整養料流加速率，不但操作簡單，而且大大地降低了生產成本。
文檔編號C12R1/89GK103045478SQ20111031877
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月14日 優先權日2011年10月14日
發明者王艷, 秦松 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所