專利名稱：：一種培育抗病小麥的方法及其專用重組質粒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種培育抗病小麥的方法及其專用重組質粒。
背景技術：
：近年來，由于小麥生產水平不斷提高，耕作制度的改變，以及全球氣候變暖等因素的影響，小麥全蝕病、紋枯病等土傳真菌病，已成為我國及世界小麥的重要病害，對小麥生產的危害日益嚴重，直接影響著小麥的最終產量。因此，防治小麥上述病害對于保證小麥高產、穩產非常重要。然而，由于小麥全蝕病、紋枯病抗性缺乏理想的小麥抗病種質資源，均由多基因控制，常規育種方法在選育抗病品種方面的研究進展緩慢。基因工程為植物抗病育種開辟了一條新途徑。小麥全蝕病又稱黑腳病，是小麥的毀滅性病害，其主要發生在根部、莖基部，引起植株成簇或大片枯死，降低有效穗數、穗粒數及千粒重，造成嚴重的產量損失。該病的病原菌為禾頂囊殼禾谷變種Gaeumannomycesgraminisvar.graminis(Sacc.)Walker禾口禾丁頁囊殼小麥變禾中Gaeumannomycesgraminis(Sacc.)ArxetOlivervar.tritici(Sacc.)Walker，其寄主范圍較廣，能侵染10多種栽培或野生的禾本科植物，如小麥、大麥、黑麥、燕麥、水稻等。小麥紋枯病又稱小麥尖眼斑病(wheatsharpeyespot)，是由禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等引起的土傳真菌病害，我國小麥紋枯病主要由禾谷絲核菌引起。70年代以來小麥紋枯病逐漸加重，到80年代已成為長江流域麥區的重大病害，后蔓延到黃淮麥區，目前已成為我國江蘇、四川、安徽、河南、山東、河北、陜西、北京等麥區的主要病害。20052010年，我國每年遭受小麥紋枯病危害的麥田面積大約在670800萬hm2，經濟損失在10億元以上。紋枯病一般可使小麥減產10%-30%，嚴重地塊減產50%以上。不僅如此，受害小麥的品質和商品價值也有很大損失。目前，生產上大面積推廣品種和育種材料對全蝕病、紋枯病的抗性普遍較差，迫切需要抗病小麥新種質和新品種。
發明內容本發明的目的是提供一種培育抗病小麥的方法及其專用重組質粒。本發明提供的融合蛋白，包括TiERFl蛋白和RC7蛋白；所述TiERFl蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質；所述RC7蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)將序列4的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質。所述蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。所述蛋白的編碼基因包括TiERFl蛋白的編碼基因和RC7蛋白的編碼基因；所述TiERFl蛋白的編碼基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子；所述RC7蛋白的編碼基因是如下4)至6)中任一所述的DNA分子4)序列表中序列5所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子；6)與4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在0.IXSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述蛋白的編碼基因可依次包括RSSlP啟動子、所述TiERFl蛋白的編碼基因和所述RC7蛋白的編碼基因；所述RSSlP啟動子啟動所述TiERFl蛋白的編碼基因的表達。所述蛋白的編碼基因可依次包括RSSlP啟動子、所述TiERFl蛋白的編碼基因⑶bi啟動子和所述RC7蛋白的編碼基因；所述RSSlP啟動子啟動所述TiERFl蛋白的編碼基因的表達。所述W^i啟動子啟動所述RC7蛋白的編碼基因的表達。含有所述融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。所述重組表達載體按照如下方法制備用限制性內切酶HindIII酶切重組質粒PA25-RC7，回收小片段并插入重組質粒pA20-TiERFl的多克隆位點，得到的重組質粒；所述重組質粒pA20-TiERFl按照如下方法制備將pAHC20質粒SphI和BamHI酶切位點之間的小片段替換為序列表的序列1所示的RSSlP啟動子、BamHI和McI酶切位點之間的小片段替換為序列表的序列2所示的TiERFl基因，得到重組質粒；所述重組質粒pA25-RC7按照如下方法制備將pAHC25質粒SmaI和McI酶切位點之間的小片段替換為序列表的序列5所示的RC7基因，得到重組質粒。所述重組表達載體具體可通過如下方法制備(1)用限制性內切酶kpl酶切所述重組質粒pA20_TiERFl回收約5.3kb的線性載體DNA片段；(2)用限制性內切酶HindIII酶切所述重組質粒pA25_RC7，回收約3.3kb的DNA片段(UBI-RC7-TN0S表達盒)。(3)將步驟O)回收的DNA片段用T4DNApolymerase進行末端平滑化處理；(4)將步驟(1)的DNA片段和步驟(3)的DNA片段進行連接，得到所述重組表達載體(pA20-TiERFl-RC7質粒)。本發明還保護一種培育抗病植物的方法，是將所述融合蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的轉基因植物。所述融合蛋白的編碼基因具體可通過所述重組表達載體導入所述目的植物中。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物優選為小麥(如揚麥18或揚麥19)。所述抗病可為抗紋枯病和/或抗全蝕病。所述紋枯病菌的致病菌具體可為禾谷絲核菌(Miizoctoniacerealis)R03010所述全燭病的致病菌具體可為Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt)。所述蛋白、所述基因或所述重組表達載體均可用于培育抗病植物。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物優選為小麥(如揚麥18或揚麥19)。所述抗病可為抗紋枯病和/或抗全蝕病。所述紋枯病菌的致病菌具體可為禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301。所述全燭病的致病菌具體可為Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt)。本發明成功構建了中間偃麥草轉錄因子基因(TiERFl基因)和水稻幾丁質酶基因(RC7基因)的單子葉植物雙價表達載體pA20-TiERFl-RC7，其中TiERFl基因受韌皮部組織特異表達的水稻蔗糖合酶基因(ricesucrosesynthase,RSS1P)啟動子的控制，RC7基因受組成型表達的玉米泛素基因(maizeubiquitin(Ubi))啟動子的控制，將該該載體轉化到小麥中，可以顯著提高轉基因小麥的綜合抗病性。圖1為重組質粒pA20_TiERFl的結構示意圖。圖2為重組質粒pA25-RC7的結構示意圖。圖3為重組質粒pA20_TiERFl的酶切鑒定(SspI)電泳圖。圖4為重組質粒pA25-RC7的酶切鑒定(HindIII)電泳圖。圖5為pA20-TiERFl_RC7質粒的酶切鑒定(SacI)電泳圖。圖6為pA20-TiERFl_RC7質粒的結構示意圖。圖7為揚麥19獲得的再生植株中部分植株TiERFl基因的PCR鑒定結果。圖8為揚麥18獲得的再生植株中部分植株RC7基因的PCR鑒定結果。圖9為轉RCT-TiERF1基因植株甲和揚麥19的照片(紋枯病抗性鑒定)。圖10為轉RCT-TiERF1基因植株乙和揚麥18的照片(全蝕病抗性鑒定)。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。引物由北京奧科生物技術公司合成。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。限制性內切SlHindIII,SmaI,SacI,SspI,BamHI禾口TaqDNApolymerase,T4DNApolymerase購自大連寶生物公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒與質粒小量提取試劑盒購自北京天根生物技術公司。Ampicillin(Amp.)購自北京拜爾迪公司。其它生化試劑為國產和進口分析純、生化純。水稻品種“日本晴”購自中國農業科學院作物科學研究所。PMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。揚麥18購自江蘇里下河地區農業科學研究所。揚麥19購自江蘇里下河地區農業科學研究所。實施例中采用的小麥紋枯病菌致病菌為禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301，購自江蘇省農業科學院。實施例中采用的小麥全蝕病致病菌為Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt),購自西北農林科技大學。實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。pAHC20質粒(5706bp)由pUC8改造而成，含有1個表達盒，具有玉米Ubiquitin啟動子、ExonJntron、Bar、Nos終止子；pAHC20質粒的參考文獻ChristensenandQuail,1996；Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,5,213-218；由作者之一贈送，公眾可以從中國農業科學院作物科學研究所獲得。pAHC25質粒(9706bp)由pUC8改造而成，含有2個表達盒，第1個表達盒具有玉米W^iquitin啟動子、ExonUntron、GUS、Nos終止子，6US兩端具有SmaI和SacI酶切位點，第2個表達盒具有玉米W^iquitin啟動子、ExonJntron、Bar、Nos終止子；pAHC25質粒的參考文獻ChristensenandQuail,1996；Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch，5，213-218；由作者之一贈送，公眾可以從中國農業科學院作物科學研究所獲得。實施例1、雙價植物表達載體的構建一、重組表達載體pA20_TiERFl的構建1、提取水稻品種“日本晴”幼葉的基因組DNA。2、以步驟1提取的基因組DNA為模板，用RSS1P-F2/RSS1P-R2組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。RSS1P-F25'-AGA|GCATGC|CTCCTTCATTTTCAGTGCAAATG-3‘(框中為SphI識別序列)；RSS1P-R25‘-ATA|GGATCC|CCAATGGTGGTCAGAGAC-3‘(框中為BamHI識別序列)。3、用限制性內切酶SphI和BamHI雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物(約1720bp)。4、用限制性內切酶SphI和BamI雙酶切pAHC20質粒，除去ubiquitin啟動子，回收骨架載體(約3700bp)。5、將步驟3的酶切產物和步驟4的骨架載體用T4連接酶進行連接(3摩爾酶切產物1摩爾骨架載體)，得到重組質粒，將重組質粒進行測序。測序結果表明，得到了重組質粒pA20-RSSlP:bar，其骨架載體為pAHC20，將SphI和BamHI酶切位點之間的Ubi啟動子替換為了序列表的序列1所示的RSSlP啟動子。6、合成TiERFl基因(TIERF1基因的核苷酸序列如序列表的序列2所示的，編碼序列表的序列3表示的TiERFl蛋白)。7、以步驟6合成的TiERFl基因為模板，用TiERFl-F/TiERFl-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。TiERFl-F5‘-TTC|GGATCC[ATGCTGCTGAACCCGGCC-3‘(框中為BamHI識別序列)；TiERFl-R5'-TCTIgAGCTCICTAGCTGACCAGCTGCTG-3‘(框中為SacI識別序列)。8、用限制性內切酶BamHI和I雙酶切步驟7的PCR擴增產物，回收酶切產物(約89Ibp)。9、用限制性內切酶BamHI和MeI雙酶切重組質粒pA20_RSSlP::bar，回收去除bar的載體骨架(約4880bp)。10、將步驟8的酶切產物和步驟9的載體骨架連接(3摩爾酶切產物1摩爾骨架載體)，得到重組質粒，將重組質粒進行測序，測序結果表明，得到了重組質粒pA20-TiERFl(約5770bp)，其骨架載體為pAHC20質粒，將SphI和BamHI酶切位點之間的小片段替換為了序列表的序列1所示的RSSlP啟動子，將BamHI和I酶切位點之間的小片段替換為了序列表的序列2所示的TiERFl基因(編碼序列表的序列3所示的TiERFl蛋白)；RSSlP啟動子控制TiERFl基因表達。重組質粒pA20_TiERFl的結構示意圖見圖1。二、重組表達載體pA25-RC7的構建1、提取水稻品種“日本晴”幼葉的總RNA，反轉錄為cDNA。2、以步驟1的cDNA為模板，用RC7-F1和RC7-R1組成的引物對進行高保真PCR擴增，得到PCR擴增產物。RC7-F1:5，-TAAGCATGTCGACGCCGA-3，；RC7-R1:5，-ACTGCTCCGCCAACCCAA-3，。PCR擴增程序94°C5min,1個循環；94°Clmin、64°C35s,72°C90s，8個循環；94°Clmin、62°C35s、72°C90s,28個循環；72°C延伸9min。3、以步驟2的PCR擴增產物為模板，用RC7-SmaF和RC7_&iCR組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。RC7-SmaF5‘-AA|CCCGGG|ATGTCGACGCCGAGAGCG-3‘(方框標注SmaI識別序列)；RC7-SacR:5‘_TA|GAGCTC|TCACTGCTCCGCCAACCCA-3，(方框標注SacI識別序列)。4、將步驟3的PCR擴增產物與pMD18_T載體連接，得到重組質粒pTRC7。5、用限制性內切酶SmaI和&icl雙酶切重組質粒pTRC7，回收約IOOObp的DNA片段。6、用限制性內切酶SmaI和McI雙酶切pAHC25質粒，回收去除⑶S基因的載體骨架(約782Obp)。7、將步驟5的DNA片段和步驟6的載體骨架連接，得到重組質粒，將重組質粒進行測序，測序結果表明，得到了重組質粒PA25-RC7，其骨架載體為PAHC25質粒，將SmaI和Mcl酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列5所示的RC7基因(編碼序列表的序列4所示的RC7蛋白)。重組質粒pA25-RC7的結構示意圖見圖2。三、雙價植物表達載體的構建1、用限制性內切酶kpl(平末端)酶切重組質粒pA20_TiERFl(37°C、5h)，酶切產物的電泳圖見圖3(酶切產物為約5.3kb的DNA片段)，回收約5.3kb的線性載體DNA片段。2、用限制性內切酶Hindi11酶切重組質粒pA25_RC7(37V、2h)，酶切產物的電泳圖見圖4(酶切產物為約5.5kb的DNA片段和約3.3kb的DNA片段)，回收約3.3kb的DNA片段(UBI-RC7-TN0S表達盒)。3、將步驟2回收的DNA片段用T4DNApolymerase進行末端平滑化處理。4、將步驟1的DNA片段和步驟3的DNA片段進行連接(16°C、20小時)，得到雙價植物表達載體(pA20-TiERFl-RC7質粒)。5、將pA20-TiERFl_RC7質粒用限制性內切酶&icl進行酶切(30°C酶切池)，然后進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，見圖5。顯示5.9kb和2.7kb兩個DNA片段。6、將pA20-TiERFl_RC7質粒用限制性內切酶BamHI進行酶切(30°C酶切濁)，然后進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳。顯示4.58kb和4.02kb兩個DNA片段。7、將pA20-TiERFl-RC7質粒用RC7-ZU和RC7-ZL組成的引物對進行PCR鑒定，反應結束后擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，顯示約724bp條帶的為陽性，pA20-TiERFl-RC7質粒的鑒定結果為陽性。RC7-ZU:5，-CCTCCTCCACCGCAACGA-3，；RC7-ZL:5，-CTGCTCCGCCAACCCAAC-3，。RC7反應程序94°C預變性5min，94°C30s,60°C30s，72°C60s，循環30次，72°C后延伸5min。8、將pA20-TiERFl-RC7質粒用Ε379和Ε702組成的引物對進行PCR鑒定，反應結束后擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，顯示約344bp的條帶的為陽性，pA20-TiERFl-RC7質粒的鑒定結果為陽性。ΤΕ379:5，-GAGGCCACGGCGTTCATG-3，；ΤΕ702:5，-GACCCGGACGAGGAGGAG-3，。RC7反應程序94°C預變性5min，94°C30s,60°C30s，72°C30s，循環30次，72°C后延伸5min。9、根據測序結果，pA20-TiERFl-RC7質粒的結構示意圖見圖6。實施例2、轉基因植株的獲得及其抗病性分析一、再生植株的獲得將揚麥18或揚麥19分別作為出發植物，進行如下步驟1、將2000塊幼胚愈傷組織作為基因槍轟擊的受體，用PDS-1000/He基因槍(Bio-Red公司生產)將pA20-TiERFl-RC7質粒轟擊到愈傷組織(IlOOPsi的可裂膜，載樣距靶材料6cm進行轟擊)。2、將愈傷組織在滲透壓培養基(SD2培養基+0.2mol/L甘露醇+0.2mol/L山梨醇)上培育16hQ6°C，暗培養)。3、將愈傷組織轉移到SD2培養基(MS培養基+lmg/LVB^lSOmg/L天冬門酰胺+2mg/L2，4-D)上，恢復培養2周(26°C，暗培養)。4、將愈傷組織轉移到分化篩選培養基(1/2MS培養基+lmg/La_萘乙酸+lmg/L激動素+3mg/L雙丙胺膦)中，24j6°C光照培養(每天光照10小時)3-4周；待到愈傷組織分化出綠芽以后，轉移到生長篩選培養基中(1/2MS培養基+3mg/L雙丙胺膦)，M-26°C光照培養(每天光照10小時)。5、步驟4的小苗伸長到l-2cm時，轉移到壯苗培養基(1/2MS培養基+0.5mg/La-萘乙酸)上，將苗高6-8cm的植株(再生植株)移栽到花盆，15°C左右光照培養(每天光照10小時)。揚麥18獲得了269株再生植株。揚麥19獲得了101株再生植株。二、轉基因植株的獲得將步驟一得到的再生植株提取基因組DNA進行TiERFl基因的PCR鑒定和RC7基9因的PCR鑒定。TiERFl基因的PCR鑒定相關參數所用的引物RSS1P-1038U20(針對RSSlP啟動子):5，-CATCCCCAACCAGTCCTTTT-3，；TIET-2088L(針對TiERFl基因):5，-CTCGGTAGTGCTTCCCCCT-3；目標片段約為1050bp；PCR擴增程序94°C預變性:3min；94°C45s,60°C50s,72°C75s，共5個循環；940C45s,58°C50s,72°C75s，共10個循環；94°C45s,56°C50s,72°C75s，共20個循環；最后72°C后延伸IOmin0反應結束后，擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。RC7基因的PCR鑒定相關參數RC7-953U20(針對RC7基因)5，-GGCAACCTCGACTGCTACAA-3，；TN0S-L23(針對NOS終止子)5，-ATGTATAATTGCGGGACTCTAAT-3，；目標片段約為^Obp。PCR擴增程序94°C預變性3min；94°C45s,58.7°C50s,72°C45s，共10個循環；94°C45s，56.5°C50s,72V45s，共25個循環；最后72°C后延伸IOmin0反應結束后，擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。揚麥19獲得的再生植株中部分植株TiERFl基因的PCR鑒定結果見圖7。M為IOObpDNAladder；CK為水；P為pA20_TiERFl_RC7質粒(陽性對照)；WT為揚麥19；1、2、4、6、7、8、9為鑒定陽性的植株。揚麥19獲得的再生植株中RC7基因的PCR鑒定結果與TiERFl基因的鑒定結果一致，即所有TiERFl基因PCR鑒定為陽性的植株，RC7基因PCR鑒定也為陽性。101株再生植株中，PCR鑒定(兩個基因均為陽性)為陽性的植株35株，即為TO代轉RCT-TiERF1基因植株甲，陽性轉化率約為1.75%。將TO代轉RCT-TiERF1基因植株甲進行自交，獲得的種子及其長成的植株為Tl代植株，獲得Tl代轉RCT-TiERF1基因植株甲。將Tl代轉RCT-TiERF1基因植株甲進行自交，獲得的種子及其長成的植株為T2代植株，獲得T2代轉RCT-TiERF1基因植株甲。揚麥18獲得的再生植株中部分植株RC7基因的PCR鑒定結果見圖8。P為pA20-TiERFl-RC7質粒(陽性對照)；WT為揚麥19;1至9為鑒定陽性的植株。揚麥18獲得再生植株TiERFl基因的PCR鑒定結果與RC7基因的鑒定結果一致，即所有RC7基因PCR鑒定為陽性的植株，TiERFl基因PCR鑒定也為陽性。269株再生植株中，PCR鑒定(兩個基因均為陽性)為陽性的植株27株，即為TO代轉RCT-TiERF1基因植株乙，轉化率為1.35%。將TO代轉RCT-TiERF1基因植株乙進行自交，獲得的種子及其長成的植株為Tl代植株，獲得Tl代轉RCT-TiERF1基因植株乙。將Tl代轉RCT-TiERF1基因植株乙進行自交，獲得的種子及其長成的植株為T2代植株，獲得T2代轉RCT-TiERF1基因植株乙。三、對照植株的獲得用重組質粒pA20-TiERFl代替pA20_TiERFl-RC7質粒，依次進行步驟一和步驟二的操作。以揚麥19為出發植株得到TO代轉pA20-TiERFl對照植株甲、Tl代轉pA20_TiERFl對照植株甲和T2代轉pA20-TiERFl對照植株甲。以揚麥18為出發植株得到TO代轉pA20-TiERFl對照植株乙、Tl代轉pA20_TiERFl對照植株乙和T2代轉pA20_TiERFl對照植株乙。用重組質粒pA25-RC7質粒代替pA20_TiERFl-RC7質粒，依次進行步驟一和步驟二的操作。以揚麥19為出發植株得到TO代轉pA25-RC7對照植株甲、Tl代轉pA25_RC7對照植株甲和T2代轉pA25-RC7對照植株甲。以揚麥18為出發植株得到TO代轉pA25_RC7對照植株乙、Tl代轉pA25-RC7對照植株乙和T2代轉pA25_RC7對照植株乙。四、轉基因植株甲及其對照植株的紋枯病菌抗性鑒定1、在網室田間種植Tl代轉RCi-TiERF1基因植株甲(6行，前5行每行20株，第6行9株)、T1代轉pA20-TiERFl對照植株甲(1行，20株)、T1代轉pA25_RC7對照植株甲(1行，20株)和揚麥19(2行，每行20株)。2、8周后(拔節期)，采用蔡士賓等的牙簽培養法(蔡士賓，任麗娟，顏偉，吳紀中，陳懷谷，吳小有，張仙義·2006,Germplasmdevelopmentandmappingofresistancetosharpeyespot(Rhizoctoniacerealis)inwheat.中國農業科學,39(5):汜8_934)接種禾谷絲核菌R0301的菌絲到小麥葉鞘部，澆水保濕5-7天，隔一周噴2-3次水。3、在收獲時拍照并考察葉鞘和莖稈的發病情況。病情分級標準按照李斯深等方法進行(李斯深，李安飛，李憲彬等.1997，小麥種質對紋枯病抗性鑒定初報.作物品種資源.⑷31-33)=IT0:無病；1級第1、2葉鞘發病，但莖稈無病；2級第1、2葉鞘發病，但病斑繞莖稈小于1/3；3級第3、4葉鞘發病，或病斑繞莖稈1/3-2/3；4級第5、6葉鞘發病，或病斑繞莖稈2/3-1周；5級出現枯、白穗或整株枯死。轉RCT-TiERF1基因植株甲中，68株(62%)ΙΤ彡1，109株植株的平均IT為1.1，轉pA20-TiERFl對照植株甲的平均IT為1.5，轉pA25_RC7對照植株甲的平均IT為1.6，揚麥19的平均IT為2.70。對紋枯病抗病性鑒定結果表明，大多數轉RCT-TiERF1基因植株甲對紋枯病抗性強于轉pA20-TiERFl對照植株甲、轉pA25_RC7對照植株甲以及揚麥19(受體小麥)。轉RCT-TiERF1基因植株甲和揚麥19的照片見圖9(1和2為轉RCT-TiERF1基因植株甲，3為揚麥19)。五、轉基因植株乙及其對照植株的紋枯病菌抗性鑒定1、在網室田間種植Tl代轉RCT-TiERF1基因植株乙(6行，前5行每行20株，第6行9株)、T1代轉pA20-TiERFl對照植株乙(1行，20株)、T1代轉pA25_RC7對照植株乙(1行，20株)和揚麥18(2行，每行20株)。步驟2和步驟3同步驟四的步驟2和步驟3。轉RCT-TiERF1基因植株乙中，58株(65%)IT彡1，109株植株的平均IT為1.05，轉pA20-TiERFl對照植株乙的平均IT為1.4，轉pA25_RC7對照植株乙的平均IT為1.5，揚麥18的平均IT為2.58。對紋枯病抗病性鑒定結果表明，大多數轉RCT-TiERF1基因植株乙對紋枯病抗性強于轉pA20-TiERFl對照植株乙、轉PA25-RC7對照植株乙以及揚麥18(受體小麥)。六、轉基因植株乙及其對照植株的全蝕病抗性鑒定將T2代轉RCT-TiERF1基因植株乙種子(15粒)、T2代轉pA20_TiERFl對照植株乙種子(15粒)、T2代轉pA25-RC7對照植株乙種子(15粒)和揚麥18(15粒)消毒、催芽后，移至已放入小麥全蝕病致病菌菌餅的花盆中(每粒種子一個花盆)，人工氣候箱培養3個星期，然后對如下指標進行鑒定黑莖比(BS%)、黑根比(B1R%)、黃葉比(YLR%)0根據以上數據，將植株的整體抗病性劃分為高抗(1級)、中感0級)、高感(3級)三個等級。結果見表1。表1各個指標的檢測結果權利要求1.一種融合蛋白，包括TiERFl蛋白和RC7蛋白；所述TiERFl蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質；所述RC7蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)將序列4的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質。2.權利要求1所述融合蛋白的編碼基因。3.如權利要求2所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因包括TiERFl蛋白的編碼基因和RC7蛋白的編碼基因；所述TiERFl蛋白的編碼基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子；所述RC7蛋白的編碼基因是如下4)至6)中任一所述的DNA分子4)序列表中序列5所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子；6)與4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子。4.如權利要求3所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因依次包括RSSlP啟動子、所述TiERFl蛋白的編碼基因和所述RC7蛋白的編碼基因；所述RSSlP啟動子如序列表的序列1所示；所述RSSlP啟動子啟動所述TiERFl蛋白的編碼基因的表達。5.含有權利要求2或3或4所述融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。6.如權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體按照如下方法制備用限制性內切酶HindIII酶切重組質粒pA25-RC7，回收小片段并插入重組質粒pA20-TiERFl的多克隆位點，得到的重組質粒；所述重組質粒pA20-TiERFl按照如下方法制備將pAHC20質粒SphI和BamHI酶切位點之間的小片段替換為序列表的序列1所示的RSSlP啟動子、BamHI和McI酶切位點之間的小片段替換為序列表的序列2所示的TiERFl基因，得到重組質粒；所述重組質粒PA25-RC7按照如下方法制備將pAHC25質粒SmaI和McI酶切位點之間的小片段替換為序列表的序列5所示的RC7基因，得到重組質粒。7.一種培育抗病植物的方法，是將權利要求2或3或4所述融合蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的轉基因植物。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因通過權利要求5或6所述重組表達載體導入所述目的植物中。9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物優選為小麥；所述抗病為抗紋枯病和/或抗全蝕病。10.權利要求1所述蛋白，或權利要求2或3或4所述基因，或權利要求5或6所述重組表達載體在培育抗病植物中的應用。全文摘要本發明公開了一種培育抗病小麥的方法及其專用重組質粒。本發明提供了一種融合蛋白、含有所述融合蛋白的編碼基因的重組質粒，及所述重組質粒在培育抗病植物中的應用。所述融合蛋白包括TiERF1蛋白和RC7蛋白；所述TiERF1蛋白是由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質。所述RC7蛋白是由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質。將含有所述融合蛋白的編碼基因的載體轉化到小麥中，可以顯著提高轉基因小麥的綜合抗病性。文檔編號C12N5/10GK102367278SQ20111031855公開日2012年3月7日申請日期2011年10月19日優先權日2011年10月19日發明者劉欣,莊洪濤,張增艷,徐惠君,李釗,杜麗璞,王愛云,祝秀亮,馬翎健申請人:中國農業科學院作物科學研究所