專利名稱：一種產單磷酸類脂a的基因工程菌及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種產單磷酸類脂A的基因工程菌及其構建方法和應用，特別是一種無需誘導直接生產單磷酸類脂A的大腸桿菌。
背景技術：
疫苗佐劑可以非特異性的增強機體對抗原的免疫應答反應，提高疫苗效率。鋁佐劑是目前全球公認的廣泛應用于人體的疫苗佐劑，安全可靠，可顯著增強體液免疫反應，但是對細胞免疫的效果不夠理想。因此，人們致力于開發更加高效安全的疫苗佐劑。MPL是一種已應用于臨床試驗的脂質體佐劑，人類臨床試驗的不良反應頻率與鋁佐劑一樣低，其炎癥毒性是LPS的0.1%。除MPL外，單磷酸類脂A (MPLA)也被證明具有疫苗佐劑潛力。目前，MPLA的生產方法主要是從沙門氏菌中提取或者化學合成。現有生產方法的缺點在于 第一、沙門氏菌是致病菌，操作起來比較困難；第二、沙門氏菌能同時合成幾種不同結構的類脂A，這給后續的分離純化帶來很多困難；第三、該方法涉及到化學處理，步驟繁多，影響產品質量和產量。本發明是構建了一株不依靠IPTG誘導的能生產MPLA的大腸桿菌基因工程菌。類脂A自細胞內膜內側開始合成，合成途徑比較保守，但在轉運到外膜外側的過程中可以發生多種修飾，以適應外界環境。目前，與類脂A結構修飾有關的基因已有報道。 利用這些基因，根據類脂A分子的合成及修飾機理，通過基因工程技術將大腸桿菌中類脂A 的結構改造成為MPLA。具體方法是在野生型大腸桿菌染色體上敲入表達IpxE基因。IpxE 來源于弗朗西斯菌，其編碼的蛋白質可以水解類脂A分子1位上的磷酸。本研究室前期構建了一株能生產MPLA的大腸桿菌基因工程菌，生產過程中需要添加IPTG誘導(Jiuzhou Chen et al.2010)。該菌株開創了 MPLA生產的新方法，但是生產過程中需要添加IPTG誘導，生產成本較高，不利于大規模生產。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種新型的產MPLA的基因工程菌，其生產過程中無需IPTG誘導，進一步降低生產成本，以適應大規模生產。為解決上述技術問題，本發明提供的基因工程菌為E.coli W3110 AlacI laCZ::i^lpxE，其中IacI發生缺失突變失活，IacZ基因基因敲入表達i^nlpxE基因。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種利用所述基因工程菌生產單磷酸類脂A的方法。其中發酵方法為常規發酵方法，單磷酸類脂A的提取方法為將過夜培養的菌液按初始OD6tltl = 0. 02轉接到200mL LB液體培養基中，37°C培養至OD6tltl = 1時8000rpm離心IOmin收集菌體，ddH20洗滌菌體一次后用Bligh-Dyer —相體系 (氯仿/甲醇/水，1 2 0.8, ν/ν/ν)懸浮菌體，磁力攪拌lh，2000rpm離心20min分相， 使用一相體系洗滌細胞碎片2-3次；加入27mL 12. 5mM的醋酸鈉(PH4. 5)溶液，超聲震蕩 10min，100°C水浴30min裂解糖鏈。冷至室溫后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer二相體系(氯仿/甲醇/水，2 2 1.8，^力，2000印111離心101^11，取下相移入旋蒸瓶中，旋轉蒸發；最后加入氯仿/甲醇溶液G l，v/v)將類脂A洗出。類脂A的檢測、分析薄層層析(TLC)檢測將樣品點于Gel 60 TLC板上，展層劑為氯仿/甲醇/水/氨水00 25 4 2，ν/ν/ν/ν)。層析結束后吹干板上殘留的展層劑，用溶于乙醇的10% 硫酸進行碳化，置于加熱板上顯色。ESI/MS分析類脂樣品溶于氯仿/甲醇溶液G 1，ν/ν)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF Mass Spectrometer質譜儀上進行質譜檢測。采用ESI離子源，陰離子檢測模式，檢測范圍小于m/z2500。本發明提供的基因工程菌在保持類脂結構單一的基礎上又降低了生產成本，且沒有引入任何抗性標記，更有利于大規模工業化生產。
圖1野生型大腸桿菌與基因工程菌類脂A TLC分析1 :W3110類脂A樣品；2 突變株HW001類脂A樣品圖2基因工程菌類脂AESI/MS分析
具體實施例方式實施例1突變株E. coli W3110 Δ IacI的構建1、IacI基因敲除片段的獲得采用化學全合成或PCR分步擴增的方法獲得IacI基因敲除片段，其兩端為IacI 基因上下游同源臂、中間為kan片段。IacI基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。將IacI基因敲除片段克隆到pBlueScript II SK (+)，獲得重組質粒pBlueScript II SK (+)-IacI(U)-pkan-lacl(D)。2、敲除感受態的制備及電轉化接種帶有Red 重組輔助質粒 pKD46 (Datsenko K A, Wanner B L. One-Step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K—12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97 (12) :6640-6645)的大腸桿菌 W3110 (ATCC39936)于含100μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，30°C，200rpm過夜培養。按2%接種量轉接IOOmL LB液體培養基，30°C，200rpm培養至OD600 = 0 . 2時加入L-阿拉伯糖(終濃度為 30mmol/L)誘導重組酶的表達，繼續培養至0D_ = 0. 5，將培養液冰浴半小時后轉入預冷的 50mL離心管中，4°C，SOOOrpm離心IOmin收集菌體，沉淀用預冷的10%甘油洗滌3次，最后用ImL 10%甘油懸浮，每管80 μ L分裝至預冷的無菌EP管中。將500_1000ng IacI敲除片段加入感受態細胞中，混勻，冰浴15mm，1. 5kv電擊 5mS，30°C孵育2h，涂布30 μ g/mL卡那霉素的LB固體平板，30°C培養，挑取轉化子于含 30 μ g/mL卡那霉素及100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，PCR驗證結果。3、溫敏型表達載體pCRE的構建根據NCBI 數據庫中 pSH47 (Guldener U, Heck S, Fielder Τ, Beinhauer J, Hegemann JH. A new efficient gene disruption cassette for repeated use inbudding yeast. Nucleic Acids Res，1996，24 :2519-2524)載體序列，采用化學全合成或 PCR方法獲得ere基因克隆到pKD46質粒，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，涂布100 μ g/ mL氨芐青霉素的LB固體平板，30°C過夜培養，挑取轉化子提質粒酶切驗證，得到Cre重組酶溫敏型表達載體，并命名為PCRE。4、突變株抗性標記的去除將PCR驗證陽性的菌株接種含30 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養基中，42 °C過夜培養，將培養液劃線30 μ g/mL卡那霉素的LB固體平板，37°C培養，挑取單菌落驗證其對氨芐青霉素的敏感性，將含有卡那霉素抗性并對氨芐青霉素敏感的菌株命名為W3110 laCI::kan并保藏。以此為出發菌株做感受態，轉入帶有重組酶Cre的溫敏型表達載體 pCRE，將陽性菌株于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，加入L-阿拉伯糖 (終濃度為30mmol/L)誘導Cre重組酶的表達，介導IoxP位點特異性重組，PCR驗證挑選轉化子。將PCR驗證正確的菌株42°C熱激后劃線LB平板，挑取單菌落驗證其對氨芐青霉素及卡那霉素的敏感性，選取對兩種抗生素均敏感的菌株命名為W3110 Δ IacI并保藏。實施例2突變菌株HW001的構建1、敲入片段!^nlpxE-Fkan的獲得根據pWSI^9-FnlpxE-Fkan (Jiuzhou Chen et al. 2010)序列，人工合成或 PCR 擴增帶有lacZ-a天然同源臂的敲入片段i^lpxE-Fkan，其核苷酸序列如SEQ IN NO. 2所示。 其中，kan基因兩側帶有FRT位點。2、敲除感受態的制備及電轉化以帶有pKD46質粒的W3110 Δ IacI菌株作為出發菌株，制備感受態，方法同前。 將500-1000ngFnlpXE-Fkan敲入片段電轉入感受態細胞中，通過kan抗性篩選獲得染色體 IacZ 基因內部敲入表達 FnlpxE-Fkan 的突變株 W3110 Δ IacI IacZ :FnlpxE_Fkan。3、突變株抗性標記的去除ffl Λ pCP20 M Ι (Cherepanov PP, Wackernagel W. Gene disruption in Escherichia coli :TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene,1995,158(1) :9-14),42°C 熱激表達FLP酶，介導FRT位點的特異性重組即可去除kan抗性標記，篩選方法同前，得到的突變株命名為HW001。實施例3突變菌株HW001的類脂A結構分析1、突變菌株HW001的類脂A提取及薄層層析(TLC)分析類脂A的提取采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法。將過夜培養的菌液按初始0D_ =0. 02轉接到200mL LB液體培養基中，37°C培養至0D_ = 1時8000rpm離心IOmin收集菌體，ddH20洗滌菌體一次后用Bligh-Dyer —相體系(氯仿/甲醇/水，1 2 0. 8， ν/ν/ν)懸浮菌體，磁力攪拌lh，2000rpm離心20min分相，使用一相體系洗滌細胞碎片2_3 次。加入27mL 12. 5mM的醋酸鈉(PH4. 5)溶液，超產震蕩lOmin，100°C水浴30min裂解糖鏈。冷至室溫后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer 二相體系(氯仿/甲醇/水， 2:2: 1.8，v/v/v)，2000rpm離心lOmin，取下相移入旋蒸瓶中，旋轉蒸發。加入氯仿/ 甲醇溶液G l,v/v)將類脂A洗出。接著進行薄層層析(TLC)檢測，將樣品點于Gel 60 TLC板上，展層劑為氯仿/甲醇/水/氨水GO 25 4 2,v/v/v/v)0層析結束后吹干板上殘留的展層劑，用溶于乙醇的10%硫酸進行碳化，置于加熱板上顯色(結果如圖1)。TLC結果顯示野生型大腸桿菌類脂A (泳道1)結構比較單一，為雙磷酸形式，而突變株HW001的類脂A (泳道2)結構為單磷酸形式，證明突變菌株在不需要IPTG誘導的前提下可以產生MPLA。2、類脂A結構的ESI/MS分析類脂樣品溶于氯仿/甲醇溶液G 1，ν/ν)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF Mass Spectrometer質譜儀上進行質譜檢測。采用ESI離子源，陰離子檢測模式，檢測范圍小于 m/z 2500。突變株HW001的類脂A結構為單磷酸形式，m/z值為1717. 5 (圖2)，而野生型大腸桿菌類脂A結構為雙磷酸形式，m/z值為1797.5。從中可以看出，突變株HW001在不需要 IPTG誘導的有大腸桿菌基因工程菌相比，本發明構建的菌株在保持類脂結構單一的基礎上又降低了生產成本，更有利于大規模工業化生產。雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
權利要求
1.一種產單磷酸類脂A的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌為.coli W3110 AlacIlacZ: JnlpxE，其中IacI發生缺失突變失活，IacZ基因敲入表達!^nlpxE基因。
2.權利要求1所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于包括如下步驟1)將人工構建的IacI敲除片段轉化E.coli W3110，獲得突變株E. coli W3110 Δ IacI，通過位點特異性重組敲除卡那霉素抗性基因；2)i^lpxE-Fkan片段電轉入步驟1)制備的Ε.coli W3110 △ IacI感受態細胞中，獲得 E. coliff3110 Δ IacI IacZ JnlpxE-Fkan，再次通過位點的特異性重組敲除其中的卡那霉素抗性基因。
3.權利要求2所述的方法，其特征在于步驟1)所述的位點特異性重組為Cre酶介導的 IoxP位點特異性重組。
4.權利要求2所述的方法，其特征在于步驟幻所述的位點特異性重組為FLP酶介導的 FRT位點特異性重組。
5.權利要求1所述基因工程菌應用于單磷酸類脂A的生產。
全文摘要
本發明公開了一種產單磷酸類脂A的基因工程菌及其構建方法和應用，屬于遺傳工程領域。所述基因工程菌為E.coli W3110 ΔlacI lacZ:: FnlpxE，其中lacI發生缺失突變失活，lacZ基因敲入表達FnlpxE基因。本發明構建的菌株在保持類脂結構單一的基礎上又降低了生產成本，其沒有引入任何外源抗性基因序列，更有利于大規模工業化生產。
文檔編號C12P7/64GK102399736SQ201110316939
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月18日 優先權日2011年10月18日
發明者李燁, 王小元, 陳久洲, 韓雅寧 申請人:江南大學