專利名稱:一種石鰈肝臟細胞系的構建方法
技術領域:
本發明涉及一種利用石鰈肝臟組織細胞建立肝臟細胞系的方法一石鰈肝臟細胞系的構建方法。
背景技術:
石鰈Ofereim力icWoratos)是溫熱帶海洋底棲魚類,盛產于我國的黃海、渤海, 是我國重要的海水養殖經濟魚類。頻繁爆發的各種病毒性疾病對石鰈養殖業帶來了嚴重的影響,造成患病石鰈大面積死亡,經濟損失嚴重,并可能通過食物鏈威脅到人類健康。目前尚無適當的藥物或疫苗可進行有效防治,亟待開發和生產安全高效的無公害漁藥。其中,將抗病毒譜廣、毒副作用小的各種中草藥有效成分應用于疾病防治,可以解決使用化學藥物造成的耐藥性和藥物殘留超標等問題,符合國際上食用性動物藥品的“低毒、無殘留、高藥效”的發展要求。因此,為了研究石鰈病毒傳播機制、宿主細胞的防御機制及病毒與宿主之間的相互作用機理,并進行中草藥有效成分抗病毒機理研究,利用病毒易于感染的石鰈肝臟組織,建立石鰈肝臟連續性細胞系是十分必要的。魚類肝臟組織含有較多的膠原和纖維組織,現有專利中的魚類細胞系構建方法中,快速剪碎組織時產生的機械剪切力,會對肝臟細胞產生很大影響,不能使肝臟原代細胞正常貼壁并增殖,所提供的各種酶消化法處理后,肝臟組織塊中細胞遷出數量少,消化后的細胞數量少,不易貼壁,且魚類肝臟組織不同于哺乳動物肝臟,無法使用目前構建哺乳動物肝臟細胞系常用的灌注消化法進行細胞系建立。因此,需要研究一種有效的石鰈肝臟細胞系的構建方法,以建立石鰈肝臟細胞系,為在分子細胞水平上研究多種中草藥有效成分的抗病毒作用機理,從而研制出病害防治中的有效治療藥物或免疫增強劑,解決日益嚴重的各種水產養殖病害。
發明內容
本發明的目的是利用石鰈肝臟組織,針對肝臟組織特點,提供一種石鰈肝臟細胞系的構建技術,以彌補現有技術的不足。本發明的構建方法首先對鮮活石鰈用75%酒精消毒處理,用紗布擦除體表粘液, 置于超凈工作臺中解剖取下肝臟組織,磷酸鹽緩沖液漂洗后粗剪成約50-100立方毫米的組織塊。根據肝臟組織特點,設定兩次酶消化處理。首先在消化液1(含0. 1%-0.2%的胰蛋白酶和0. 1%-0. 2%EDTA的磷酸鹽緩沖液)中對處理好的肝臟組織塊消化5-10分鐘,用血清中和反應后,離心收集肝臟組織塊;再在消化液11(0. 1%-0. 2% IV型膠原酶的DMEM/F12培養液)中進行第二次酶消化處理,首先用滴管緩慢吹打組織塊,使其混合均勻,靜置消化0. 5 小時后將上部懸液取出;再加入新的消化液II,慢速將肝臟組織塊繼續剪至小于1立方毫米(約0. 5-1小時)后,繼續消化1小時,消化完畢后,混合所得細胞懸液,經200目鋼網過濾,離心收集后,用含有5%胎牛血清、1%。_2%。比例的硫酸軟骨素和1%0 -2%。比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的PH值為7. 0-7. 4的DMEM/F12培養液充分懸浮,均勻接種于已用0. 1%明膠預先鋪板的24孔細胞培養板中,22-24°C下貼壁1小時后,每孔加入ImL石鰈肝臟細胞專用增殖培養液,置22-24°C生化培養箱中培養,第二天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養液一次,待石鰈肝臟細胞長滿培養孔后,將細胞懸浮、混合,轉至25毫升培養瓶中培養, 每隔3-5天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養液一次;待細胞長成單層后,使用濃度為 0. 125%-0. 25%胰蛋白酶溶液消化,按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養;所述的石鰈肝臟細胞專用增殖培養液配方為含有20%胎牛血清、1%。_2%。比例的硫酸軟骨素和1%。-2%。比例的 N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、pH值為7. 0-7. 4的DMEM/F12培養液。為了促進石鰈肝臟細胞的分裂和快速增殖,本發明又添加了 0. 02% -0. 04%。的人肝細胞生長因子和10%-20%的已抽濾的石鰈肝臟抽提液。本發明的有益效果是針對石鰈肝臟組織特點,采用兩步酶消化法,避免原代培養中常規酶消化法及組織塊處理時機械剪切力對肝臟細胞造成的影響,獲得的原代肝臟細胞可以正常貼壁生長,并通過添加多種細胞外基質成分及添加物,使肝臟細胞快速增殖,連續傳代并成功建系,經這種方法所構建的肝臟細胞系現已傳至第110代,細胞仍保持石鰈肝臟細胞的特性,該細胞系可在分子細胞水平上進行魚類病毒學研究并進行相關治療藥物的研制。
具體實施例方式將上述本發明的方法按照細致步驟進行詳述如下
1、石鰈肝臟組織塊的初步處理首先對鮮活石鰈用75%酒精浸泡5-10分鐘,用紗布擦除體表粘液,置于超凈工作臺中解剖取下肝臟組織,磷酸鹽緩沖液漂洗2遍后在含有5%胎牛血清的DMEM/F12培養液中將肝臟組織粗剪成約50-100立方毫米的組織塊,SOOrpm離心收集肝臟組織塊。2、對肝臟組織塊進行兩步酶消化法處理在消化液I (含0. 1%-0. 2%的胰蛋白酶和0. 1%-0. 2%EDTA的磷酸鹽緩沖液)中對上一步處理好的肝臟組織塊消化5-10分鐘,加入 2滴胎牛血清中和反應后,IOOOrpm離心收集肝臟組織塊;再在肝臟組織塊中加入消化液II (0. 1%-0. 2% IV型膠原酶的DMEM/F12培養液),用滴管緩慢吹打組織塊,使其混合均勻,靜置消化0. 5小時后將上部細胞懸液取出;再加入新的消化液II,慢速將肝臟組織塊繼續剪至小于1立方毫米(約0. 5-1小時)后,繼續消化1小時。3、石鰈肝臟細胞專用增殖培養液的配制取常規配制的DMEM/F12培養液(pH 7. 0-7. 4) 3. 0毫升,加入硫酸軟骨素5 10毫克,N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽5_10毫克,完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌,加入1毫升胎牛血清,補加常規配制的DMEM/F12培養液至5. 0毫升,即為本發明的石鰈肝臟細胞專用培養液。為了促進石鰈肝臟細胞的分裂和快速增殖,并添加石鰈肝臟細胞所需的眾多未知的促分裂增殖因子,達到其最佳生長條件, 本發明又添加了 0. 02%。-0. 04%。的人肝細胞生長因子和10%-20%的已抽濾的石鰈肝臟抽提液,此石鰈肝臟抽提液為將石鰈肝臟組織勻漿經0. 22微米的微孔濾膜過濾除去其他雜質而得。4、石鰈肝臟細胞培養的獲得及原代培養的啟動混合消化完畢后的細胞懸液經200目鋼網過濾,離心收集后,用1毫升含有5%胎牛血清、1%。-2%。比例的硫酸軟骨素和 1%0 _2%。比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的DMEM/F12培養液(pH值7. 0-7. 4)充分懸浮,均勻接種于已用0. 1%明膠預先鋪板的24孔細胞培養板中,每孔加入的細胞懸液覆蓋底部即可, 22-24°C下貼壁1小時后,每孔加入ImL石鰈肝臟細胞專用增殖培養液,置22_24°C生化培養箱中培養,第二天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養液一次,待石鰈肝臟細胞長滿培養孔后,將多個孔中細胞懸浮混合,轉至25毫升培養瓶中培養,每隔3-5天,吸出2. 5毫升上述25毫升培養瓶中的培養液,以去除未貼壁的組織和死細胞,加入2. 5毫升新鮮的石鰈肝臟細胞專用培養液。5、石鰈肝臟細胞的傳代培養待石鰈肝臟細胞長成單層后,吸出培養瓶中的培養液,向每個培養瓶中加入1毫升濃度為0. 125%-0. 25%的胰蛋白酶溶液,靜置消化0. 5-1分鐘;吸去胰蛋白酶溶液,將剛剛吸出的5毫升舊培養液加回,用滴管吹打培養瓶底制成石鰈肝臟細胞懸液;從每個培養瓶中分別取出2. 5毫升肝臟細胞懸液,分別加入到新的培養瓶中,每個培養瓶補加上述專用培養液2. 5毫升,使之最終體積至5毫升;待石鰈肝臟細胞再次長成單層后,仍以上述的相同方法進行傳代培養,至細胞系建立。實施例1
將鮮活石鰈于盛有75 %酒精的容器中浸泡消毒5-10分鐘,用紗布擦除體表粘液,移入超凈工作臺中,用棉球擦拭魚體表后解剖取出肝臟組織,置于盛有磷酸鹽緩沖液的燒杯中漂洗2遍;轉入含有5%胎牛血清DMEM/F12培養液的青霉素小瓶中粗剪成約50-100立方毫米的組織塊;SOOrpm離心收集肝臟組織塊,加入消化液I (含0. 1%的胰蛋白酶和0. 1%EDTA 的磷酸鹽緩沖液)對肝臟組織塊消化5分鐘;加入2滴胎牛血清中和反應后,IOOOrpm離心收集組織塊;再在消化液II (0. 1% IV型膠原酶的DMEM/F12培養液)中,用滴管緩慢吹打組織塊將酶液與組織塊混合均勻,靜置消化0. 5小時后,取出上部細胞懸液,再加入新的消化液II,慢速將肝臟組織塊繼續剪至小于1立方毫米(約0. 5小時)后,繼續消化1小時。取常規配制的DMEM/F12培養液(pH 7. 0-7. 4) 3. 0毫升,加入硫酸軟骨素5毫克, N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽5毫克,完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌,加入1毫升胎牛血清,補加常規配制的DMEM/F12培養液至5. 0毫升,即為本發明的石鰈肝臟細胞專用培養液。為了促進石鰈肝臟細胞的分裂和快速增殖,并添加石鰈肝臟細胞所需的眾多未知的促分裂增殖因子,達到其最佳生長條件,本發明又添加了 0. 02%。的人肝細胞生長因子和 20%的已抽濾的石鰈肝臟抽提液,此石鰈肝臟抽提液為將石鰈肝臟組織勻漿經0. 22微米的微孔濾膜過濾除去其他雜質而得。混合消化完畢后的細胞懸液經200目鋼網過濾,IOOOrpm離心收集后,用1毫升含有5%胎牛血清、1%。比例的硫酸軟骨素和1%。比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的DMEM/F12培養液(PH值7. 0-7. 4)充分懸浮,均勻接種于已用0. 1%明膠預先鋪板的24孔細胞培養板中, 每孔加入的細胞懸液覆蓋底部即可,22°C下貼壁1小時后,每孔加入ImL石鰈肝臟細胞專用增殖培養液,置22°C生化培養箱中培養,第二天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養液一次,待石鰈肝臟細胞長滿培養孔后,將多個孔中細胞懸浮混合,轉至25毫升培養瓶中培養, 每隔3-5天,吸出2. 5毫升上述25毫升培養瓶中的培養液,以去除未貼壁的組織和死細胞, 加入2. 5毫升新鮮的石鰈肝臟細胞專用培養液。待石鰈肝臟細胞長成單層后,吸出培養瓶中的培養液,向每個培養瓶中加入1毫升濃度為0. 125%的胰蛋白酶溶液,靜置消化1分鐘;吸去胰蛋白酶溶液,將剛剛吸出的5毫升舊培養液加回,用滴管吹打培養瓶底制成石鰈肝臟細胞懸液;從每個培養瓶中分別取出2. 5毫升肝臟細胞懸液,分別加入到新的培養瓶中, 每個培養瓶補加上述專用培養液2. 5毫升,使之最終體積至5毫升;待石鰈肝臟細胞再次長成單層后,仍以上述的相同方法進行傳代培養,至細胞系建立。實施例2
將鮮活石鰈于盛有75 %酒精的容器中浸泡消毒5-10分鐘,用紗布擦除體表粘液,移入超凈工作臺中,用棉球擦拭魚體表后解剖取出肝臟組織,置于盛有磷酸鹽緩沖液的燒杯中漂洗2遍;轉入含有5%胎牛血清DMEM/F12培養液的青霉素小瓶中粗剪成約50-100立方毫米的組織塊;SOOrpm離心收集肝臟組織塊,加入消化液I (含0. 1%的胰蛋白酶和0. 2%EDTA 的磷酸鹽緩沖液)對肝臟組織塊消化10分鐘;加入2滴胎牛血清中和反應后,IOOOrpm離心收集組織塊;再在消化液II (0. 2% IV型膠原酶的DMEM/F12培養液)中,用滴管緩慢吹打組織塊將酶液與組織塊混合均勻,靜置消化0. 5小時后,取出上部細胞懸液,再加入新的消化液II,慢速將肝臟組織塊繼續剪至小于1立方毫米(約1小時)后,繼續消化1小時。取常規配制的DMEM/F12培養液(pH 7. 0-7. 4)3. 0毫升,加入硫酸軟骨素10毫克, N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽5毫克,完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌,加入1毫升胎牛血清,補加常規配制的DMEM/F12培養液至5. 0毫升,即為本發明的石鰈肝臟細胞專用培養液。為了促進石鰈肝臟細胞的分裂和快速增殖,并添加石鰈肝臟細胞所需的眾多未知的促分裂增殖因子,達到其最佳生長條件,本發明又添加了 0. 02%。的人肝細胞生長因子和 10%的已抽濾的石鰈肝臟抽提液,此石鰈肝臟抽提液為將石鰈肝臟組織勻漿經0. 22微米的微孔濾膜過濾除去其他雜質而得。混合消化完畢后的細胞懸液經200目鋼網過濾,IOOOrpm離心收集后,用1毫升含有5%胎牛血清、2%。比例的硫酸軟骨素和1%。比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的DMEM/F12培養液(PH值7. 0-7. 4)充分懸浮,均勻接種于已用0. 1%明膠預先鋪板的24孔細胞培養板中, 每孔加入的細胞懸液覆蓋底部即可,24°C下貼壁1小時后,每孔加入ImL石鰈肝臟細胞專用增殖培養液,置24°C生化培養箱中培養,第二天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養液一次,待石鰈肝臟細胞長滿培養孔后,將多個孔中細胞懸浮混合,轉至25毫升培養瓶中培養, 每隔3-5天,吸出2. 5毫升上述25毫升培養瓶中的培養液,以去除未貼壁的組織和死細胞, 加入2. 5毫升新鮮的石鰈肝臟細胞專用培養液。待石鰈肝臟細胞長成單層后,吸出培養瓶中的培養液,向每個培養瓶中加入1毫升濃度為0. 125%的胰蛋白酶溶液,靜置消化0. 5分鐘;吸去胰蛋白酶溶液,將剛剛吸出的5毫升舊培養液加回,用滴管吹打培養瓶底制成石鰈肝臟細胞懸液;從每個培養瓶中分別取出2. 5毫升肝臟細胞懸液,分別加入到新的培養瓶中,每個培養瓶補加上述專用培養液2. 5毫升,使之最終體積至5毫升;待石鰈肝臟細胞再次長成單層后,仍以上述的相同方法進行傳代培養,至細胞系建立。實施例3
將鮮活石鰈于盛有75 %酒精的容器中浸泡消毒5-10分鐘,用紗布擦除體表粘液,移入超凈工作臺中,用棉球擦拭魚體表后解剖取出肝臟組織,置于盛有磷酸鹽緩沖液的燒杯中漂洗2遍;轉入含有5%胎牛血清DMEM/F12培養液的青霉素小瓶中粗剪成約50-100立方毫米的組織塊;SOOrpm離心收集肝臟組織塊,加入消化液I (含0. 2%的胰蛋白酶和0. 2%EDTA 的磷酸鹽緩沖液)對肝臟組織塊消化5分鐘;加入2滴胎牛血清中和反應后,IOOOrpm離心收集組織塊;再在消化液II (0. 2% IV型膠原酶的DMEM/F12培養液)中,用滴管緩慢吹打組織塊將酶液與組織塊混合均勻,靜置消化0. 5小時后,取出上部細胞懸液,再加入新的消化液II,慢速將肝臟組織塊繼續剪至小于1立方毫米(約1小時)后,繼續消化1小時。取常規配制的DMEM/F12培養液(pH 7. 0-7. 4)3. 0毫升,加入硫酸軟骨素10毫克, N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽10毫克,完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌,加入1毫升胎牛血清,補加常規配制的DMEM/F12培養液至5. 0毫升,即為本發明的石鰈肝臟細胞專用培養液。為了促進石鰈肝臟細胞的分裂和快速增殖,并添加石鰈肝臟細胞所需的眾多未知的促分裂增殖因子,達到其最佳生長條件,本發明又添加了 0. 04%。的人肝細胞生長因子和 10%的已抽濾的石鰈肝臟抽提液,此石鰈肝臟抽提液為將石鰈肝臟組織勻漿經0. 22微米的微孔濾膜過濾除去其他雜質而得。混合消化完畢后的細胞懸液經200目鋼網過濾,IOOOrpm離心收集后,用1毫升含有5%胎牛血清、2%。比例的硫酸軟骨素和2%。比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的DMEM/F12培養液(PH值7. 0-7. 4)充分懸浮,均勻接種于已用0. 1%明膠預先鋪板的24孔細胞培養板中, 每孔加入的細胞懸液覆蓋底部即可,24°C下貼壁1小時后,每孔加入ImL石鰈肝臟細胞專用增殖培養液,置24°C生化培養箱中培養,第二天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養液一次,待石鰈肝臟細胞長滿培養孔后,將多個孔中細胞懸浮混合,轉至25毫升培養瓶中培養, 每隔3-5天,吸出2. 5毫升上述25毫升培養瓶中的培養液,以去除未貼壁的組織和死細胞, 加入2. 5毫升新鮮的石鰈肝臟細胞專用培養液。待石鰈肝臟細胞長成單層后,吸出培養瓶中的培養液,向每個培養瓶中加入1毫升濃度為0. 25%的胰蛋白酶溶液,靜置消化0. 5分鐘;吸去胰蛋白酶溶液,將剛剛吸出的5毫升舊培養液加回,用滴管吹打培養瓶底制成石鰈肝臟細胞懸液;從每個培養瓶中分別取出2. 5毫升肝臟細胞懸液,分別加入到新的培養瓶中,每個培養瓶補加上述專用培養液2. 5毫升,使之最終體積至5毫升;待石鰈肝臟細胞再次長成單層后,仍以上述的相同方法進行傳代培養,至細胞系建立。
權利要求
1.一種石鰈肝臟細胞系的構建方法,其特征是它包括如下步驟對鮮活石鰈用75%酒精消毒處理,用紗布擦除體表粘液,置于超凈工作臺中解剖取下肝臟組織,磷酸鹽緩沖液漂洗后粗剪成約50-100立方毫米的組織塊;進行兩步酶消化法后,混合所得細胞懸液;經 200目鋼網過濾,離心收集后,用含有5%胎牛血清、1%。_2%。比例的硫酸軟骨素和1%0 -2% 比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的DMEM/F12培養液充分懸浮,均勻接種于已用0. 1%明膠預先鋪板的24孔細胞培養板中,22-24°C下貼壁1小時,每孔再加入ImL石鰈肝臟細胞專用增殖培養液,置22-24°C生化培養箱中培養,第二天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養液一次,待石鰈肝臟細胞長滿培養孔后,轉至25毫升培養瓶中培養,每隔3-5天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養液一次;待細胞長成單層后,使用濃度為0. 125%-0. 25%胰蛋白酶溶液消化,按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養,并最終建立石鰈肝臟細胞系;所述石鰈肝臟細胞專用增殖培養液配方為含有20%胎牛血清、1%。_2%。比例的硫酸軟骨素和1%0 -2%。比例的 N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的DMEM/F12培養液pH值7. 0-7. 4。
2.如權利要求1所述的構建方法,其特征是所述兩步酶消化法是指在消化液I中消化肝臟組織塊5-10分鐘,消化液I中含0. 1%-0. 2%的胰蛋白酶和0. 1%-0. 2%EDTA的磷酸鹽緩沖液,離心收集組織塊后再加入消化液II,消化液II是0. 1%-0. 2% IV型膠原酶的DMEM/F12 培養液,混合均勻靜置消化0. 5小時后將上部懸液取出;再加入新的消化液II,用0. 5-1小時慢速將肝臟組織塊繼續剪至小于1立方毫米后,繼續消化1小時,獲得所需的肝臟細胞。
3.如權利要求2所述的構建方法,其特征是在上述石鰈肝臟細胞專用增殖培養液中添加了占上述專用增殖培養液0. 02% -0. 04%。的人肝細胞生長因子和10%-20%的已抽濾的石鰈肝臟抽提液。
全文摘要
本發明涉及一種石鰈肝臟細胞系的構建方法,它是以石鰈肝臟組織細胞為材料,采用兩步酶消化法啟動原代培養,在含胎牛血清、肝細胞生長因子、硫酸軟骨素、N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽和石鰈肝臟抽提液的DMEM/F12培養液pH值7.0-7.4中培養;采用胰蛋白酶消化法進行傳代培養;本發明工藝科學合理,避免了常規細胞系構建中的酶消化法對石鰈肝臟細胞的損傷,細胞可正常貼壁生長,各培養液添加物有效促進了肝臟細胞的增殖,由本發明構建的石鰈肝臟細胞系目前已傳至第110代,細胞增殖狀態良好,可望應用該細胞系進行分子細胞水平上多種中草藥有效成分對魚類病毒進行抗病毒作用機理研究,從而研制出病害防治中的有效治療藥物或免疫增強劑,解決日益嚴重的各種水產養殖病害。
文檔編號C12N5/071GK102321569SQ20111031688
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者劉書花, 張瑞凌, 徐建榮, 李福偉, 王興民, 魏云波 申請人:山東省分析測試中心