專利名稱：一株利用木薯為原料生產丁醇的丙酮丁醇梭菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，特別是一株利用木薯為原料生產丁醇的丙酮丁醇梭菌及其發酵丁醇中的應用。
背景技術：
在化工生產中，丁醇是一種重要的精細化工原料，用途非常廣泛。既可用作溶劑， 生產鄰苯二甲酸二丁酯等增塑劑及丁醛、磷酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯等化學品，也被作為油脂、藥物和香料的萃取劑。在可替代石油的液體燃料上，丁醇由于具有高能量密度、低親水性、高辛烷值以及不易揮發等遠遠優異于乙醇的特點，因而被認為是適宜替代石油的新一代液體燃料能源。石油能源危機引起了各國對未來能源供應不足的普遍關注，并促使人類尋求可再生的生物基材料來代替石油。因而，利用生物發酵的方法來生產丁醇獲得了人們的青睞。在丁醇發酵生產過程中原料成本占了約60-70 %，是生物發酵丁醇推廣應用的瓶頸。生物發酵丁醇的傳統原料是玉米。玉米是糧食類作物，價格高，而且市場供應波動大。開發非糧、廉價的生物質原料是丁醇生物發酵生產的迫切要求。木薯單位面積的生物產量高于絕大多數栽培作物，是中國華南地區栽種的主要作物之一。木薯已是南方地區酒精發酵的主要原料。但目前的丁醇發酵工業中使用的丁醇發酵菌株對于木薯原料的利用能力很弱。工業界和各個研究小組對于新型丁醇發酵菌株的研究一直沒有中斷。但現有的研究在對木薯的利用上面進展不大。如中國專利申請CN95111733.5公開了一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌及其培養方法與應用，其中涉及的產高丁醇梭菌利用玉米作為發酵原料，可以獲得丁醇的高比例生產。但是這個菌株在木薯為原料的培養基中發酵能力很弱，丁醇產量不高。而中國專利申請CN101353632A公開了一株丙酮丁醇梭菌及其篩選方法和用途，涉及到一個高丁醇產量的突變菌株的篩選，這個突變體對馬鈴薯淀粉具有高的利用能力。這些研究沒有涉及到利用木薯高產丁醇的菌株。
發明內容
本發明的目的是提供一株利用木薯為原料生產丁醇的丙酮丁醇梭菌，其突出的優勢在于以木薯作為原料具有高丁醇的生產能力。這個菌株具有很好的發酵優化和遺傳改造前景，同時也具有重要的工業應用價值。本發明通過以下技術方案達到上述目的提供一株利用木薯為原料生產丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1，該菌株保藏在中國典型培養物保藏中心，CCTCCM 2011觀0，保藏日期2011年8月9日，地址中國武漢市武昌珞珈山武漢大學內。所述的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以玉米為原料發酵丁醇中的應用，所述發酵培養基為含玉米淀粉的培養液。所述的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以木薯為原料發酵丁醇中的應用，所述發酵培養基為含木薯淀粉的培養液，所述含木薯淀粉的培養液中的木薯淀粉質量百分含量為10%，0. 6g/L硫酸鎂、0. 5g/L的硫酸二氫鉀以及3g/L的醋酸銨。發酵的溫度為37°C。 本發明所提供的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1特性在于具有發酵生產丁醇的能力。特別是在以木薯淀粉作為原料的發酵液中具有發酵丁醇達到 13. 02g/L的能力。
具體實施例方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。1、丙酮丁醇梭菌的分離純化采集自南寧郊區的植物根系土樣10份。將土樣裝入有IOmL的TYA培養基試管中， 培養基組成葡萄糖40克，牛肉膏2克，酵母膏2克，胰蛋白胨6克，醋酸銨3克，磷酸二氫鉀0. 5克，七水硫酸鎂0. 2克和七水硫酸鐵0. 01克，混合后，在沸水中加熱1分鐘，在厭氧培養箱中于37°C溫度下培養。定期觀察，挑出有氣泡產生的試管，在TYA培養基中加入1.5% 瓊脂，在平板中分離單菌落。單菌落轉移到含有質量百分比為8%玉米粉培養基進行培養， 挑選出生長和產氣快速的菌株再轉移到8%木薯淀粉培養基中培養。從木薯培養基中挑選出一株生長速度快、丁醇產量高的菌株gxaslS-l。對菌株gxasl8-l的16s rDNA的序列分析表明，菌株gxasl8_l與Clostridium acetobutylicumATCC 824 的 16s ribosomal RNA 基因的相似性為 100%，因而 gxas 18-1 菌株為丙酮丁醇梭菌。2、以玉米為原料發酵產丁醇將菌株gxas 18-1用TYA培養基靜置培養M小時，作為發酵種子液。將發酵種子液按照體積百分比5%接種到裝有0. 5L質量百分含量為10%的玉米粉的培養基的1. 3L發酵罐中進行厭氧發酵，通入氮氣來祛除氧。發酵溫度為37°C，在IOOrpm轉速培養，發酵時間為48小時。發酵液用氣相色譜測定丁醇含量。測定結果丁醇為11^6g/L，ABE總溶劑為 17.92g/L03、以木薯為原料發酵產丁醇將菌株gxas 18-1用TYA培養基靜置培養M小時，作為發酵種子液。將發酵種子液按照體積百分比5%接種到裝有0. 5L質量百分含量為10%的木薯粉的發酵培養基中，添加有0. 6g/L硫酸鎂、0. 5g/L的硫酸二氫鉀以及3g/L的醋酸銨的1. 3L發酵罐中進行厭氧發酵，通入氮氣來祛除氧。發酵溫度為37°C在IOOrpm轉速培養，發酵時間為48小時。發酵液用氣相色譜測定丁醇含量。測定結果丁醇為13. 07g/L, ABE總溶劑為21. 53g/L。在以木薯淀粉為原料的發酵液中，菌株gxas 18-1的丁醇發酵量不但大于玉米原料的發酵量，而且超過了野生型菌株耐受13g/L的丁醇極限。4、丁醇的測定方法氣相色譜檢測條件為樣品前處理12000轉/分離心1分鐘，取上清液200微升， 加入等體積(質量分數)的正丙醇作為內標;Agilent 6800氣相色譜儀，色譜條件柱溫220°C，載氣N2，流速0. 7毫升/分鐘，壓力7萬帕斯卡，進樣量0. 2微升，檢測器氫火焰檢測器。
丁醇標準品購自國藥集團化學試劑有限公司，在如上色譜條件下標準品的保留時間為3. 30分鐘。
權利要求
1.一株利用木薯為原料生產丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1，其特征在于，該菌株保藏在中國典型培養物保藏中心，CCTCC M 2011280o
2.權利要求1所述的利用木薯為原料生產丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在發酵生產丁醇中的應用。
3.權利要求1所述的利用木薯為原料生產丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以玉米為原料發酵丁醇中的應用，其特征在于發酵培養基為含玉米淀粉的培養液。
4.權利要求1所述的利用木薯為原料生產丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以木薯為原料發酵丁醇中的應用，其特征在于發酵培養基為含木薯淀粉的培養液，所述含木薯淀粉的培養液中的木薯淀粉質量百分含量為10%， 0. 6g/L硫酸鎂、0. 5g/L的硫酸二氫鉀以及3g/L的醋酸銨，發酵的溫度為37°C。
全文摘要
本發明公開了一株利用木薯為原料生產丁醇的丙酮丁醇梭菌及其應用。該丙酮丁醇梭菌保藏在中國典型培養物保藏中心，CCTCC M 2011280。這個菌株具有發酵生產丁醇的能力，特別是在以木薯為原料的發酵培養基中丁醇的發酵量可以達到13.07g/L。
文檔編號C12N1/20GK102417888SQ20111031536
公開日2012年4月18日 申請日期2011年10月17日 優先權日2011年10月17日
發明者劉春宇, 左文樸, 龐浩, 裴建新, 黃志民, 黃日波 申請人:廣西科學院