專利名稱：檢測病源細胞的靶向性分子及其應用的制作方法
檢測病源細胞的靶向性分子及其應用技術領域
本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及檢測病源細胞的靶向性分子及其制備方法和應用。
背景技術：
眾多臨床數據和研究表明，對病源細胞的定量檢測是準確判斷患者病情并給予及時治療的直接證據。例如，血液中循環腫瘤細胞的數量是決定病人預后的重要因素。同樣， 對血液中的瘧原蟲的檢測也是判斷瘧疾病情的重要指標。
傳統的檢測方法基本是基于對病源細胞表面抗原的檢測和定量。在這些方法中， 抗體首先被附著在一個固體載體上，由于抗體-抗原的相互作用抗體和待檢測細胞形成復合物。同樣的原理，抗體可能先通過抗原-抗體反應和待檢細胞形成復合物，然后再附著到一個固體載體上。其后，被抗體抓住的細胞被收集和標記以此來定量。比如免疫熒光技術檢測循環腫瘤細胞。首先用附著于磁珠或微流體芯片的抗體將腫瘤細胞從血液中富集出來。 然后用帶有標記物、腫瘤細胞特異性的抗體標記腫瘤細胞并進行定量檢測。一般來說，標記物包括放射性的同位素，染料，熒光素和酶(用于酶標反應)等。盡管基于抗原捕獲的檢測方法在臨床上應用廣泛，但是這些方法有許多不足之處
(I)檢測靈敏度低。抗原酶標檢測主要是通過對細胞抗原直接進行檢測。這些方法的檢出限受到目標細胞表面抗原數量的限制，檢測限通常在 10_9m。因此在細胞數量稀有時(抗原濃度< I(T12M)，靈敏度不夠。因此，目前本領域非常有必要開發新的檢測試劑或方法，以提高檢測的靈敏度。
(2)通量低。這些方法的通量受限于人工。因此，通量較低，不適用于大量篩查。
(3)操作麻煩且人為誤差大。傳統方法的操作步驟繁復，人工要求高。因此不可避免有很多人為引入的實驗誤差，從而導致檢測結果的可信性下降。
(4)多重檢測。對樣本的多個抗原進行同時檢測是臨床診斷和治療分型的重要指導指標。由于標記物的限制，傳統的方法最多在同一個檢測樣本中對病源細胞的3-4個抗原進行同時檢測。因此，不可能對樣本的抗原進行大規模掃描。
現今技術對某種細胞的檢測往往基于一個A-B的二聯體理念:A代表一個針對細胞的特異性的、高親和性的配體分子(Kd < 10_6M)，比如單克隆抗體、高親和性的多肽片段、 高親和性化學小分子等，用于特異性地結合目標細胞的表面抗原代表一個或多個染料標記分子，用于定量檢測分子A。A和B可以是通過化學共價鍵偶聯的分子。例如，抗⑶45 的抗體通過化學鍵CO-NH和熒光標記分子熒光素琥珀酰亞胺酯鍵合。此熒光素抗CD45的抗體可以用于特異性的熒光標記并定量檢測白細胞。A和B也可以是通過非化學鍵鍵合的分子對(如氫鍵、范德華力等)。比如，A代表生物素共價鍵偶聯的抗CD45的抗體，B代表親和素共價鍵偶聯的堿性磷酸酶，用于檢測和定量。A和白細胞表面的CD45抗原結合，而B 通過生物素和親和素的氫鍵結合從而達到檢測的目的。
上述這些方 法雖然可以很便捷地檢測目標細胞，但是這些方法的檢出限受到目標細胞表面抗原數量的限制，檢測限通常為 IO-9M,靈敏度并不高。
因此，目前本領域非常有必要開發新的檢測試劑或方法，以提高檢測的靈敏度。發明內容
本發明的目的在于提供靶向性分子偶聯的寡聚核苷酸探針及其制備方法。
在本發明的第一方面，提供一種檢測病源細胞的靶向性分子，結構如下
X-Y ；
其中，X代表特異性靶向病源細胞的結合分子；
Y代表寡核苷酸探針；
代表X和Y之間的共價連接(鍵合)、偶聯或偶合的關系。
在一個優選例中，X選自特異性靶向病源細胞的抗體、配體、化學小分子或多肽。
在另一優選例中，所述的X對于病源細胞的平衡解離常數小于10_6mOl/L(M)。
在另一優選例中，所述的病源細胞是腫瘤細胞，X是葉酸或葉酸-半胱氨酸偶聯物。
在另一優選例中，所述的腫瘤細胞是循環腫瘤細胞(CTC)。
在另一優選例中，所述的寡核苷酸探針是經過化學修飾的寡核苷酸探針，所述的化學修飾增強列寡核苷酸探針的穩定性。
在另一優選例中，所述的寡核苷酸探針的序列中，磷酸鍵上存在硫代修飾。
在另一優選例中，所述的“磷酸鍵上存在硫代修飾”是指寡核苷酸探針的序列中， P-O發生硫代脫氧而形成P-S。
在另一優選例中，所述的“磷酸鍵上存在硫代修飾”發生在部分磷酸鍵上或發生在所有磷酸鍵上。
在另一優選例中，所述的寡核苷酸探針是單鏈或是雙鏈。
在另一優選例中，所述的寡核苷酸探針的長度是10_150bp (雙鏈)或 10-150nt (單鏈)；較佳地，所述的寡核苷酸探針的長度是20-100bp (雙鏈)或20_100nt (單鏈)；更佳地，所述的寡核苷酸探針的長度是20-80bp (雙鏈)或20-80nt (單鏈)。
在本發明的另一方面，提供一種制備靶向性分子的方法，所述靶向性分子結構如下
X-Y ；
其中，X代表特異性靶向病源細胞的結合分子，該結合分子是葉酸-半胱氨酸偶聯物；
Y代表寡核苷酸探針；
代表X和Y之間的共價連接(鍵合)、偶聯或偶合的關系；
所述方法包括
(a)將寡核苷 酸與琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶液混合，將寡核苷酸上的氨基和琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯以C-N共價鍵鍵合，獲得寡核苷酸-琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯鍵合產物；
(b)在寡核苷酸-琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯鍵合產物中加入葉酸-半胱氨酸偶聯物，將葉酸-半胱氨酸的硫基和琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯上的馬來酰亞胺以C-S共價鍵鍵合；獲得寡核苷酸-葉酸-半胱氨酸產物。
在本發明的另一方面，提供所述的靶向性分子的用途，用于制備檢測病源細胞的試劑或試劑盒。
在本發明的另一方面，提供一種檢測病源細胞的試劑盒，其中包括所述的靶向性分子。
在另一優選例中，所述的試劑盒中包括1-100種靶向性分子，各靶向性分子中X相同或不同，且Y的堿基序列不同；從而，當靶向性分子多于一種時，該試劑盒可用于對不同的病源細胞或同一病源細胞表面上不同的特定分子進行多重檢測。
在另一優選例中，所述的試劑盒中還包括特異性擴增所述的靶向性分子中寡核苷酸探針的引物；和/或
特異性針對所述的靶向性分子中寡核苷酸探針的檢測探針，該檢測探針攜帶可檢測標記。
在另一優選例中，所述的引物針對所述的靶向性分子中的寡核苷酸探針的兩端序列；所述的檢測探針與所述的靶向性分子中的寡核苷酸探針的中間序列互補。
在另一優選例中，所述的引物針對所述的靶向性分子中的寡核苷酸探針的兩端序列；所述的檢測探針與所述的寡核苷酸探針中與引物序列互補的序列位置之外的中間序列位置互補。
在另一優選例中，所述的引物的長度是8_50bp ;較佳地是10_30bp。
在另一優選例中，所述的檢測探針是熒光探針，其攜帶的可檢測標記是熒光分子； 更佳地，所述的檢測探針是TaqMan探針。
在本發明的另一方面，提供一種檢測病源細胞的方法，包括
(I)將所述的靶向性分子與待測樣品共混，孵育；
(2)孵育結束后收集細胞，從細胞上洗脫所述的靶向性分子(較佳地，用pH2. 5的甘氨酸緩沖液洗脫)；
(3)以步驟(2)洗脫的靶向性分子為模板，進行PCR定量分析，根據定量分析結果獲知待測樣品中病源細胞的存在情況以及存在量。
在另一優選例中，所述的引物針對所述的靶向性分子中的寡核苷酸探針的兩端序列；所述的檢測探針與所述的靶向性分子中的寡核苷酸探針的中間序列互補。
在另一優選例中，所述的引物針對所述的靶向性分子中的寡核苷酸探針的兩端序列；所述的檢測探針與所述的寡核苷酸探針中與引物序列互補的序列位置之外的中間序列位置互補。
在另一優選例中，所述的引物的長度是8_50bp ;較佳地是10_30bp。
在另一優選例中，所述的檢測探針是熒光探針，其攜帶的可檢測標記是熒光分子； 更佳地，所述的檢測探針是TaqMan探針。
在另一優選例中，步驟(3)中，以特異性針對(擴增)該靶向性分子中寡核苷酸探針的引物和/或特異性針對所述的靶向性分子中寡核苷酸探針的檢測探針(該檢測探針攜帶可檢測標記)進行PCR擴增，獲得PCR定量分析結果；根據定量分析結果獲知待測樣品中病源細胞的存在情況以及存在量。
在另一優選例中，步驟(3)中，還設置對照組和/或標準品組，籍此分析待測樣品中病源細胞的存在情況以及存在量。
在另一優選例中，所述的檢測病源細胞的方法是非診斷性或治療性的。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1、對制備獲得的產物進行HPLC分析(260nm)。
A、葉酸-半胱氨酸-SSP025的HPLC純度分析圖譜；
B、葉酸-半胱氨酸-SSP045的HPLC純度分析圖譜；
C、葉酸-半胱氨酸-ssPOlOO的HPLC純度分析圖譜；
D、葉酸-半胱氨酸-ssPS45的HPLC純度分析圖譜；
E、葉酸-半胱氨酸-dsP045的HPLC純度分析圖譜。
圖2、對制備獲得的產物進行紫外分光光度分析。
A、葉酸-半胱氨酸偶聯物的紫外分光光度分析；
B、未偶聯的ssP025的紫外分光光度分析；
C、葉酸-半胱氨酸-ssP025偶聯體的紫外分光光度分析；
D、葉酸-半胱氨酸-ssP045偶聯體的紫外分光光度分析；
E、葉酸-半胱氨酸-ssPS45偶聯體的紫外分光光度分析；
F、葉酸-半胱氨酸-ssPOlOO偶聯體的紫外分光光度分析。
圖3、對葉酸-半胱氨酸-寡聚核苷酸探針與葉酸受體的親和力進行檢測，獲得葉酸-半胱氨酸-SSP025的競爭結合曲線。
圖4、葉酸-半胱氨酸-寡聚核苷酸探針的PCR檢測，不同長度探針的擴增結果。
圖5、對表4數據進行線性回歸分析。將標準品中的細胞數量作為獨立變量，平均檢出的細胞數量作為依賴變量，結果得到縱軸截距1. 99，斜率為1. 159 ;及R2 = 0. 99。
圖6、分別獲自3個病例的胸水樣品用葉酸-半胱氨酸-0G(0G為oregon green 488，是一種熒光分子，綠色，染的是葉酸受體)和DAPI染色(藍色，染的是細胞核)的結果， 其中左列為光學透射成像結果，用于觀察細胞的形態；右列為葉酸-半胱氨酸-OG和DAPI 的染色結果。單呈藍 色的為白細胞；藍、綠兩色雙染的為癌細胞。
具體實施方式
本發明揭示了一種新的檢測病源細胞的試劑和方法，本發明的方法通過對標記物寡聚核苷酸進行信號放大，提高了病源細胞表面特定分子的檢測靈敏度(檢測限為 I(T14M);且不同的寡聚核苷酸序列可以對多種待檢測分子進行編碼，因此可以實現多重檢測。
術語
如本文所用，所述的“病源細胞”是指來自于病灶組織的細胞(固定于病灶組織或由病灶組織釋放并游離存在于體液中)，該細胞表面上存在有特定分子(例如表面抗原或受體)，該特定分子為該種病源細胞所特有的，且能夠被特定的結合分子(如抗體、配體)結合，該特定的結合分子即為特異性靶向病源細胞的結合分子。例如，葉酸可以識別和結合癌細胞表面的葉酸受體(folate receptor),抗Her2的單克隆抗體可以識別和結合于乳癌細胞表面的Her2抗原；LHRH多肽可以識別和結合前列腺癌細胞表面的黃體生成素釋放激素受體(LHRH receptor)等等。
如本文所用，所述的“結合分子”能夠特異性地靶向病源細胞上特定分子(例如表面抗原或受體)，其具有高的親和性，其對于的平衡解離常數通常小于10_6。所述的“結合分子”例如但不限于抗體、配體、化學小分子或多肽等。
如本文所用，所述的“特異性針對靶向性分子中寡核苷酸探針的引物”是指一條引物或一對引物，其至少部分序列可以與靶向性分子中的寡核苷酸探針互補，該引物可通過 PCR技術來擴增寡核苷酸探針的序列。所述的引物通常是引物對，包括與寡核苷酸探針兩端互補的正向和反向的序列。
如本文所用，所述的“癌癥”或“腫瘤”沒有特別的限制，較佳地該“癌癥”或“腫瘤” 自發病起會向血液循環中散播癌癥細胞或腫瘤細胞。例如選自(但不限于)鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、宮頸癌、白血病、口腔癌、唾液腺腫瘤、鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤、喉癌、耳部腫瘤、眼部腫瘤、甲狀腺腫瘤、縱隔腫瘤、胸壁、胸膜腫瘤、小腸腫瘤、膽道腫瘤、胰腺與壺腹周圍腫瘤、腸系膜與腹膜后腫瘤、腎臟腫瘤、腎上腺腫瘤、膀胱腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、陰莖癌、子宮內膜癌、卵巢惡性腫瘤、惡性滋養細胞腫瘤、外陰癌與陰道癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、軟組織腫瘤、骨腫瘤、皮膚及附件腫瘤、惡性黑色素瘤、神經系統腫瘤、小兒腫瘤。作為本發明的優選實施方式，所述的“癌癥”或“腫瘤”選自乳(腺)癌、肺癌。
如本文所用，所述的“平衡解離常數(equilibriumdissociation constant,Kd) ” 指占據半數細胞上特定的受體或表面分子所需的配體、抗體、化學小分子或多肽的濃度。Kd 值與受體親和力呈反向關系，Kd值愈小，表明親和力愈高；反之Kd值愈大，表明親和力愈低。通常Kd小于10_6M表示受體或表面分子與的配體、抗體、化學小分子或多肽親和力高。
如本文所用，所述的“特異性”是指是抗體、配體、多肽或化學小分子能識別和/或結合于循環腫瘤細胞表面的特定分子(如表面抗原、受體)上，但不識別和結合于其它非相關分子。
如本文所用，所述的“TaqMan熒光探針”為一種寡核苷酸，其兩端分別標記一個熒光發射基團(作為可檢測信號)和一個熒光淬滅基團。當探針完整時，熒光發射基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’ -3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發射基團和熒光淬滅基團分離，從而通過熒光檢測系統可接受到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，即熒光信號的累計與PCR產物形成的完全同步，從而實現定性和定量。
如本文所用，所述的“循環腫瘤細胞(CTC) ”是指存在于血液(外周血)中的癌癥 (腫瘤)細胞，CTC的濃度可以診斷癌癥、對癌癥進行分期、預后等。
基本原理
本發明的方法主要基于結`合分子-寡(聚)核苷酸探針，所述的結合分子特異性靶向病源細胞表面的特定分子。所述的寡核苷酸探針用于作為后續PCR定量分析的擴增模板。所述的結合分子通過與病源細胞表面的特定分子結合，對病源細胞進行標記。而寡聚核苷酸通過定量PCR技術用于對配體進行定量檢測從而達到對待檢細胞進行定量的目的。
基于上述原理所實現的技術效果如下首先，由于PCR對寡聚核苷酸的擴增效應， 可以將檢測限大大降低；其次，PCR的技術可以對大量樣本在2小時內進行檢測，通量高；再次，由于寡聚核苷酸的多樣性，可以對不同的病源細胞或同一種病源細胞表面的不同受體進行多重檢測。因此，本發明的試劑和方法解決了傳統方法許多不能解決的問題。
靶向性分子
本發明的靶向性分子主要是基于以下結構
X-Y ；
其中，X代表一個特異性的針對病源細胞的高親和性分子(通常Kd < 10_6mol/L)， 比如抗體、高親和性的多肽片段、高親和性化學小分子等，用于特異性地結合病源細胞上的特定分子；γ用于作為后續PCR定量分析的擴增模板，用于目標病源細胞的定量檢測。
X是發揮導向作用的關鍵分子，其是用于識別和/或結合病源細胞的，因此，其通常根據所需檢測的病源細胞的類型而設，例如葉酸可以識別和結合肺癌細胞表面的葉酸受體(folate receptor);抗Her2的單克隆抗體可以識別和結合于乳癌細胞表面的Her2 抗原；LHRH多肽可以識別和結合前列腺癌細胞表面的黃體生成素釋放激素受體(LHRH receptor)。
目前，針對存在于各種病源細胞表面的特定分子，已經有深入的研究，也開發出了各種針對這些表面分子的結合分子，包括抗體、配體、多肽、化學小分子等。本發明對結合分子沒有特別的限制，這些結合分子均可被應用于本發明的方法中，從而設計出各種針對病源細胞的靶向性分子。
Y是具有一定長度的寡核苷酸分子，基于該寡核苷酸分子可設計出特異性的引物從而實現PCR擴增，通過擴增效應降低檢測限，提高檢測的敏感性。所述的寡核苷酸分子可以是雙鏈的或是單鏈的。所述的寡核苷酸的序列沒有特別的限定，較佳地其不與人體或動物體的基因序列互補，本領域人員熟知其設計以及合成的方法。所述寡核苷酸的長度較佳地可以是10-150bp (雙鏈)或10-150nt (單鏈)。
本發明還包括采用如基于核酸鏈骨架修飾技術等手段獲得的經修飾的寡核苷酸分子，所述的修飾基本不改變寡核苷酸分子結合特性；優選那些能夠提高寡核苷酸分子穩定性的修飾。例如，所述的修飾為硫代修飾，或在核糖的2’位置進行烷基修飾。應理解，任何能夠保持所述寡核苷酸分子結合特性的修飾都包含在本發明中。
寡核苷酸的骨架修飾方法有多種，包括硫代法，該方法是將DNA骨架上磷酸鍵上的氧原子用硫原子替代，所述的硫代可以是全部磷酸鍵上的硫代或是部分磷酸鍵上的硫代。硫代的修飾能夠大大增強所述寡核苷酸分子的穩定性，從而有利于獲得準確的檢測結果O
較佳地，X和Y之間以化學共價鍵的形式連接。
作為本發明的優選方式，本發明人在反復研究后，開發了檢測循環腫瘤細胞 (CTC)的靶向性分子。這是由于葉酸可以識別和結合腫瘤細胞表面的葉酸受體(folate receptor)。該靶向性分子中，X是葉酸或葉酸-半胱氨酸偶聯物。葉酸與半胱氨酸的偶聯物與天然葉酸相比較，提高了與葉酸受體的親和力；并且，將葉酸與半胱氨酸相連，可以顯著地增加葉酸的溶解性，從而提高與循環腫瘤細胞接觸的葉酸的量。葉酸-半胱氨酸偶聯物的制備可以采用本領域已知的技術進行。與葉酸連接的半胱氨酸的個數可以是一個或多個的，例如I 3個，該范圍內的半胱氨酸可為葉酸提供良好的親水環境。該靶向性分子中， Y的序列是多種多樣的，且是硫代的或非硫代的。
試劑盒
本發明開發的一種或多種靶向性分子可被包含在試劑盒中，從而便于本領域技術人員的操作。
與所述靶向性分子配套的引物也可被包含在試劑盒中，該引物通常是引物對，包括正向的和反向的與所述的靶向性分子的兩端序列互補的序列，從而可以以所述的靶向性分子為模板，進行PCR擴增，實現檢測結果的放大。
較佳地，所述的試劑盒中還包括熒光PCR用的熒光探針，例如TaqMan探針，從而便于PCR產物的定量分析。
所述的試劑盒中，所述靶向性分子及其配套的弓I物或熒光探針被獨立地裝于合適的容器中，更佳地所述靶向性分子及其配套引物或熒光探針還被配制成合適的用量或濃度。
所述的試劑盒中還可包含其它試劑，例如用于PCR擴增的試劑(如DNA聚合酶， Realtime PCR Master Mix)、緩沖液(如 PBS)、洗漆液等。
所述試劑盒還可包括試劑盒使用說明書，以指導技術人員的操作。
應用
本發明還涉及利用所述的靶向性分子來檢測病源細胞的方法，所述的方法可以是以診斷疾病為目的的，例如對患者進行預后，或判斷疑似人群是否罹患疾病；或以非診斷疾病為目的的，例如，純粹的科學研究，或純粹的細胞分型(如區分腫瘤細胞的類別)。
所述的檢測病源細胞的方法包括(I)將所述的靶向性分子與待測樣品共混，孵育；(2)孵育結束后收集細胞，從細胞上洗脫所述的靶向性分子；(3)以步驟(2)洗脫的靶向性分子為模板，以特異性針對(擴增)該靶向性分子中寡核苷酸探針的引物進行PCR擴增，獲得PCR定量分析結果；根據該定量分析結果獲知待測樣品中病源細胞的存在情況以及存在量。
所述的PCR優選熒光定量PCR技術，因此，較佳地，在PCR擴增系統中還加入熒光探針，從而可藉由特定的定量PCR儀方便地實現分析；更佳地，所述的熒光探針是TaqMan探針。
作為本發明的優選方式，還設置對照組和/或標準品組，即已知葉酸-半胱氨酸-寡聚核苷酸探針數量的組，通常設置一系列數量不同的標準品構成標準品組，籍此分析待測樣品中病源細胞的存在情況以及存在量。
下面結合 具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
材料
H-Cys (Trt) -2-C1 Trt 樹脂、HBTU和 HOBT 均購自 Novabiochem (U. S. A.)。紅細胞裂解液購自索萊寶生物(北京，中國)。氨基修飾的單鏈寡聚核苷酸(SSP025，SSP045，SSP052， ssPOlOO)、PBS> CD45 Dynabeads 磁珠和 PCR 檢測試劑購自 Invitrogen (Long Island, U.S.A.)。SMCC (琥拍酰亞胺-4-環己燒-1-碳酸酯)購自 Thermo Scientific (U. S. A.) 所用細胞株均購自中科院細胞庫(上海，中國)。葉酸-半胱氨酸-OG(oregon green 488) 分子如下制備。除非另外說明，實施例所用的葉酸是Y葉酸。寡聚核苷酸和PCR的引物購自 Invitrogen 公司。PD-10 柱(Sephadex G-25M)購自 General Electrical Healthcare (美國)。定量PCR的試劑購自TOYOBO公司(日本)。定量PCR儀為Applied Biosystems 的7300realtime PCR system。其余試劑均購自Sigma Aldrich。葉酸抗體購自Cortez Diagnostics (美國)。
“葉酸-半胱氨酸-0G”制備方法如下
首先，合成葉酸-半胱氨酸偶合物。將441mg的Y葉酸慢慢溶入20mL 二硫甲砜， 然后加入1. 2mmol的二環己基碳二亞胺和2mmol的N-羥基硫代琥珀酰亞胺于50°C反應6 小時。此反應得到的Y葉酸-N-羥基硫代琥珀酰亞胺和10倍等摩爾量的半胱氨酸加入50 微升吡啶在25°C反應5小時。粗產物(其中包含Y葉酸-半胱氨酸和α-異構體-半胱氨酸)用20mL乙腈沉淀并離心收集。隨后產物用乙醚洗三遍。收集的產物最后用真空干燥，并稱量，重量為390mg。此粗產物用美國Agilent Technologies的Microsorb碳-18制備型反相高效液相色譜柱(250mmX21mm)分離純化。Y葉酸-半胱氨酸的洗脫時間分別為 7. 6分鐘。分離的Y葉酸-半胱氨酸(此為脂鍵CO-NH連接的偶合物，含2個半胱氨酸) 為58mg,得率為12%。然后,將純化后的1.5mg偶合物在100 μ L的二硫甲砜中溶解,并加入1. Omg的Oregon Green 488琥珀酰亞胺酯并在室溫孵育4小時。反應后的產物用高效液相色譜純化，獲得Oregon Green 488 (簡稱0G)熒光標記的葉酸探針(稱為葉酸-半胱氨酸-0G)。
實施例1、雙鏈寡聚核苷酸探針的制備
用經滅菌的去離子水分別溶解序列互補的兩條單鏈寡聚核苷酸(其中一條單鏈用氨基(Amino)修飾)，配制成50 μ M單鏈寡聚核苷酸溶液。如下設置退火反應體系
去除核酸酶的水40μ I ；
退火緩沖液(5Χ)20μ1(其中 IOmM Tris, pH 7. 5-8. 0,50mM NaCl, ImM EDTA);正向鏈 F-ssP045 (50 μ M) 20 μ I ;反向鏈 R_ssP045 (50 μ Μ) 20 μ I ;總體積 100 μ I。
按照上述順序依次加入各種試劑，混勻。然后如下設置PCR儀進行退火反應
權利要求
1.一種檢測病源細胞的靶向性分子，結構如下X-Y ；其中，X代表特異性靶向病源細胞的結合分子；Y代表寡核苷酸探針；代表X和Y之間的共價連接、偶聯或偶合的關系。
2.如權利要求1所述的靶向性分子，其特征在于，X選自特異性靶向病源細胞的抗體、 配體、化學小分子或多肽。
3.如權利要求2所述的靶向性分子，其特征在于，所述的病源細胞是腫瘤細胞，X是葉酸或葉酸-半胱氨酸偶聯物。
4.如權利要求3所述的靶向性分子，其特征在于，所述的腫瘤細胞是循環腫瘤細胞。
5.如權利要求1所述的靶向性分子，其特征在于，所述的寡核苷酸探針的序列中，磷酸鍵上存在硫代修飾。
6.一種制備靶向性分子的方法，所述靶向性分子結構如下X-Y ；其中，X代表特異性靶向病源細胞的結合分子，該結合分子是葉酸-半胱氨酸偶聯物；Y代表寡核苷酸探針；代表X和Y之間的共價連接、偶聯或偶合的關系；所述方法包括(a)將寡核苷酸與琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯溶液混合，將寡核苷酸上的氨基和琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯以C-N共價鍵鍵合，獲得寡核苷酸-琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯鍵合產物；(b)在寡核苷酸-琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯鍵合產物中加入葉酸-半胱氨酸偶聯物，將葉酸-半胱氨酸的硫基和琥珀酰亞胺-4-環己烷-1-碳酸酯上的馬來酰亞胺以 C-S共價鍵鍵合；獲得寡核苷酸-葉酸-半胱氨酸產物。
7.權利要求1所述的靶向性分子的用途，用于制備檢測病源細胞的試劑或試劑盒。
8.—種檢測病源細胞的試劑盒，其中包括權利要求1所述的靶向性分子。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，其中還包括特異性擴增權利要求1所述的靶向性分子中寡核苷酸探針的引物；和/或特異性針對權利要求1所述的靶向性分子中寡核苷酸探針的檢測探針，該檢測探針攜帶可檢測標記。
10.一種檢測病源細胞的方法，包括(1)將權利要求1所述的靶向性分子與待測樣品共混，孵育；(2)孵育結束后收集細胞，從細胞上洗脫權利要求1所述的靶向性分子；(3)以步驟(2)洗脫的靶向性分子為模板，進行PCR定量分析，根據定量分析結果獲知待測樣品中病源細胞的存在情況以及存在量。
全文摘要
本發明涉及檢測病源細胞的靶向性分子及其制備方法和應用。本發明的方法通過對標記物寡聚核苷酸進行信號放大，提高了病源細胞表面特定分子的檢測靈敏度；且不同的寡聚核苷酸序列可以對多種待檢測分子進行編碼，因此可以實現多重檢測。
文檔編號C12N15/10GK103045720SQ20111031528
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月17日 優先權日2011年10月17日
發明者何偉, 楊國華, 呂娟, 韓寧寧, 李英輝, 郭志偉 申請人:格諾思博生物科技(上海)有限公司, 南通中博醫藥科技有限公司