專利名稱：一種用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測領域，具體涉及一種用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器。
背景技術：
目前檢測銅離子的主要方法是光譜法，包括原子光譜法、分子吸收光譜法、熒光光譜法，還有電化學分析法和化學傳感方法等。原子光譜法應用廣泛，檢測準確，但需要大型儀器，需要專業技術人員的操作，前處理麻煩。近年來化學傳感方法因其極高的靈敏度被廣泛應用于各個領域，其中也包括了重金屬的檢測。但是目前使用的這些方法均涉及到熒光基團的使用，熒光基團容易淬滅，不易保存，且檢測時需要使用到熒光檢測儀，限制了其應 用范圍。近年來，納米材料的發展為解決這一問題提供了新的思路。納米金顆粒具有優異的光學性質、電學性質、化學活性和生物兼容性，在生物領域得到廣泛應用。研究表明，納米金溶液的顏色與納米金顆粒的間距以及納米金聚集體的大小有關。納米金顆粒的間距若明顯超過其平均直徑，納米金呈分散狀態，宏觀上表現為紅色；該間距若小于平均直徑，則納米金易團聚，呈聚集態，宏觀上表現為紫色到藍色。利用納米金的這種性質，可設計一系列生化反應以改變納米金顆粒間的距離，從而實現對靶物質的檢測。2007年，Lu等利用依賴銅離子的核酸酶，在核酸酶上標記熒光基團，在其互補的底物序列上標記淬滅基團，當銅離子不存在時，沒有熒光；當銅離子存在時，核酸酶切割其互補的底物序列，熒光基團和淬滅基團分離，出現熒光，其靈敏度的線性范圍從35nM到20 PM。同年，White等合成了一段具有銅離子特異性的多肽片段(Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly)，同樣通過熒光共振能量轉移的原理，來檢測銅離子的存在，其檢測靈敏度為32y g/L。但是這些方法均牽涉到熒光基團的使用，熒光基團容易淬滅，不易保存，且檢測時候需要使用到熒光檢測儀，檢測成本仍然較高，限制其應用范圍。因此，一種能快速檢測、不需要儀器使用且靈敏度高的檢測方法會極大的滿足市場的需求。此發明正致力于此。
發明內容
本發明的目的是克服現有Cu2+檢測技術存在的問題和不足，提供一種用于Cu2+快速檢測的新工具，即核酸納米金生物傳感器，利用Cu2+存在時，針對銅離子的特異的核酸酶能夠切斷與他互補的底物這一原理，配合膠體金放大系統，用來檢測溶液中Cu2+的存在。并提供該核酸納米金生物傳感器的制備方法。本發明的技術原理是結合有第三段序列的膠體金噴布在金標墊上，用鏈霉親和素和標記有生物素的第四段序列反應后，劃在硝酸纖維素膜上形成檢測線；用鏈霉親和素和標記有生物素的第五段序列反應后，劃在硝酸纖維素膜上形成質控線。首先將核酸酶和底物以一定比例混合，然后將待測樣品加入其中，反應。如果待測樣品中含有銅離子，則核酸酶會切斷與其互補的底物序列，釋放出圖I中綠色和紫紅色標記的序列部分，這段序列首先經過金標墊，與膠體金顆粒上標記的第三段核酸序列發生互補反應，然后經過檢測線，同樣與檢測線上標記的第四段核酸序列發生互補反應，膠體金顆粒停留在檢測線上，從而使得檢測線顯紅色；繼續經過質控線，剩余沒有反應的膠體金顆粒，其上標記的序列與質控線上標記的第五段核酸序列發生互補反應，使得質控線顯紅色，為陽性結果。(圖3)如果待測樣品中沒有銅離子，則核酸酶不會切斷其互補的底物序列，上樣后，由于底物序列被與其互補的酶序列所占據，則不會與膠體金顆粒上標記的序列發生反應，檢測線不顯色，但膠體金顆粒上標記的序列仍然能與質控線上的序列發生反應，質控線顯紅色，為陰性結果。如果質控線不顯色，不管檢測線顯色與否，都說明生物傳感器本身出現了問題，結果不可信，無效結果。(圖3)。根據本發明的技術原理，設計的五段核酸序列是
第一段為銅離子特異性的核酸酶序列，含有35個堿基(SEQ ID NO: I)，第14-35個堿基形成一個回文結構；
第二段為其互補的底物序列，包含48個堿基(SEQ ID N0:2)，5’端與酶完全互補，3’端比酶序列長，為一段單鏈片段，互補序列含有一個脫氧核糖核苷酸G，它是酶活性的關鍵部位，酶切位點就位于其5’端；
第三和第四段序列為檢測序列，其中第三段序列用于膠體金標記，序列為(5’ -SH-SEQID N0:3-3’)；第四段序列標記在檢測線上，序列為(5，- biotin- SEQ ID NO:4 -3，)，底物在未酶切條件下不能與其它兩段序列形成夾心結構，而酶切后互補片段變短則能被第三段序列置換形成夾心。這兩段序列分別與被酶切后長片段的兩端互補(即圖I中綠色和紫紅色部分)；
第五段序列為質控序列。標記在質控線上，它與膠體金顆粒上標記的第三段序列互補，用于檢測生物傳感器的穩定性。其序列為(5’ - SEQ ID N0:5-biotin-3，)。本發明所述的核酸納米金生物傳感器包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標記的核酸序列3，該核酸序列是由巰基修飾并與膠體金偶聯形成的，所述硝酸纖維素膜上有質控線和檢測線，質控線上固定有核酸序列5，該核酸序列與膠體金顆粒上標記的第三段序列互補，用生物素標記并與鏈霉親和素反應后，固定與硝酸纖維素膜上的，用于檢測生物傳感器的穩定性。檢測線上固定有核酸序列4，底物在未酶切條件下不能與其它兩端序列形成夾心結構，而酶切后互補片段變短則能被第三段序列置換形成夾心。生物素標記的核酸序列4與鏈霉親和素反應后，固定在硝酸纖維素膜上形成檢測線。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明巧妙的把膠體金放大系統和針對銅離子的特異的核酸酶結合起來，設計出了一種高靈敏度、低費用、不需要使用任何儀器的膠體金試紙條生物傳感器。既解決了以往檢測方法中需要大型儀器的缺陷，又能保證檢測靈敏度，而且制備簡便、檢測迅速，不需要專業的技術人員。
圖I銅離子特異性的核酸酶及其底物； 圖2試紙條整體結構方案；
圖3試紙條檢測樣品效果圖；圖4本發明所述核酸納米金生物傳感器檢測銅離子的實驗技術路線 圖5本發明所述核酸納米金生物傳感器檢測銅離子的靈敏度結果圖； 圖6本發明所述核酸納米金生物傳感器檢測銅離子的特異性結果圖。
具體實施例方式實施例I核酸納米金生物傳感器的制備
I、五種核酸序列的設計
在已有Cu2+依賴酶活性DNAzyme的基礎上，對其互補鏈也就是底物的5’進行延伸，以用于酶切后核酸夾心的檢測(見圖I)。具體設計序列SEQ ID N0:l 5。2.納米金(膠體金)的制備
向250ml的圓底燒瓶中稱取IOOg O. 01%的HAuCL4溶液，磁力攪拌加熱至沸騰；然后向上述溶液中迅速加入4ml 1%的檸檬酸三鈉，溶液變為紅色后，繼續煮沸lOmin，停止加熱繼續攪拌直至冷卻；膠體金溶液4°C避光保存，納米金通過520nm最大吸光度值鑒定。3. 金標核酸的制備
用ΙΟΟμΙ去離子水溶解IOD核酸序列3，加入到Iml 5倍體積濃縮的膠體金溶液中，40C 24小時；1%的牛血清白蛋白封閉30分鐘后，加入NaCl和1%的SDS’分別至終濃度為O. 15Μ和O. 01%, 40C過夜，11500轉/分鐘離心20分鐘，棄上清，沉底用500ul重懸液(20mM Na3PO4, 5% BSA, O. 25% Tween,和10%蔗糖)重懸，重復洗三遍后用200ul的重懸液重新懸浮，制成懸浮液。4.樣品墊的處理
玻璃纖維浸泡含有pH9. 0,4. 0% TritonX-100、IOOmM 硼酸、3%PEG4000、1%BSA、2%蔗糖，
0.1% SDS，50. OnM競爭 DNA 探針(SEQ ID NO:6), O. 5ug/ml 鮭魚精 DNA 的溶液后，37°C烘干備用。5.金標墊的制備
將本發明制備的金標核酸序列3涂于玻璃纖維上，37°C干燥2個小時，制成金標墊，備用。6.硝酸纖維素膜上質控線和檢測線的處理
用去離子水溶解IOD的核酸序列5，使其濃度為ΙΟΟμΜ，取15μ1 ΙΟΟμΜ的核酸序列5，加入15μ1 (lmg/ml)鏈和親霉素，室溫下反應2小時后，采用劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜質控線上，37°C干燥兩個小時。用去離子水溶解10D的核酸序列4，使其濃度為ΙΟΟμΜ,取15μ1 ΙΟΟμΜ的核酸序列4，加入15μ1 (lmg/ml)鏈和親霉素，室溫下反應2小時后，采用劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜檢測線上，37°C干燥兩個小時。7.膠體金試紙條的組裝
將固定有寡核苷酸探針的硝酸纖維素膜、吸水紙、涂有納米微粒標記寡核苷酸探針的玻璃纖維、樣品墊依次固定于膠板上，相鄰部分彼此重疊2mm，經切割成寬4mm后即得到本發明所述的核酸納米金生物傳感器。質量控制標準
(I)C線(質控線)出現紅色的線證明納米金生物傳感器有效。
(2) T線(檢測線)出現紅色的線與否，是陽性陰性判別的標準。結果判定標準
(1)C線出現紅色的線，同時T線出現紅色的線，說明被檢樣品中Cu2+含量超標；
(2)C線出現紅色的線，同時T線沒有出現紅色的線，說明被檢樣品中Cu2+含量沒有超
標；
(3)C線沒有出現紅色的線，說明納米金生物傳感器失效。實施例2前述核酸納米金生物傳感器的質量控制與檢測效果
采用實施例I所制成的核酸納米金生物傳感器，進行以下實驗，驗證其檢測效果。
I.配制銅離子標準溶液梯度，濃度分別為100. O μΜ, 10. O μ Μ, I. O μ Μ,100. O ηΜ, 50. O ηΜ, 10. O ηΜ, O. O ηΜ，室溫保存。2.配制 20. 0μ M 的 Hg2+, Mn2+, Cd2+, Pb2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ba2+, Ca2+,Ni2+，Co2+溶液。3. ￠(2. OyL 100.0 μ M 核酸酶、10. O μ L 100. O μ M 酶底物和 190. O μ L 4Χ SSC(ρΗ7. 4)于EP管中，混勻，70°C水浴鍋加熱2分鐘，置于溫水中緩慢冷卻，此時核酸酶和酶底物的濃度分別為I. O μ M和5. O μ M ;
然后取10. Oy L上述反應溶液與90. Oy L 8 X SSC (ρΗ7. 4)混合，使得核酸酶和酶底物的終濃度分別為100. O ηΜ和500. O ηΜ。分別將15. O μ L工作液和15. O μ L不同濃度的標準品溶液混合，使得核酸酶和酶底物的終濃度分別為50. O ηΜ和250. O ηΜ,緩沖液濃度為4X SSC (ρΗ7. 4)，室溫反應30分鐘。4.將配置的上樣溶液滴在樣品墊上，室溫；10分鐘后觀察質控線和檢測線的顏色變化。結果顯示最低檢測線可以達到10. O ηΜ，遠超過美國環保署對于飲用水中銅離子的最高含量(20μΜ)的標準。在Cu2+存在的條件下，檢測線均顯出肉眼可見的紅色，并且，隨著Cu2+濃度的增加，檢測線的顏色也逐漸加深，用金標試紙條讀數儀的結果也一致，隨著Cu2+濃度的增加，檢測線的曲線也逐漸增大，質控線顯色。在Cu2+存在的條件下，核酸酶特異性的切開其互補的底物序列，產生待檢測的單鏈核酸序列，從而與膠體金上標記的第三段序列和檢測線上劃的第四段序列形成夾心結構，使檢測線顯紅色。并且，Cu2+的濃度越高，核酸酶的效率越快，切斷的底物序列也隨之增加，使得檢測線的顏色也逐漸加深。同時，質控線也呈現均一的紅色，說明生物傳感器的體系正常，結果可信。5.分別將15. O μ L工作液和15. O μ L不同離子的標準品溶液混合，使得核酸酶和酶底物的終濃度分別為50. O ηΜ和250. O ηΜ,緩沖液濃度為4X SSC (ρΗ7. 4)，室溫反應30分鐘。上述反應溶液滴在樣品墊上，室溫；10分鐘后觀察質控線和檢測線的顏色變化。結果顯示在20. O μ M的條件下，只有Cu2+的檢測線顯出肉眼可見的紅色，Co2+有微弱的紅色，其它 Hg2+，Mn2+，Cd2+，Pb2+，Mg2+，Zn2+，Fe2+，Fe3+，Ba2+，Ca2+，Ni2+均不顯色。圖中左邊是實物拍攝圖，右邊是用傳感器讀卡儀讀出來的相對應的曲線圖。該結果顯示出了此生物傳感器有著良好的特異性。只有在Cu2+存在的條件下，核酸酶才能特異性的切開其互補的底物序列，產生待檢測的單鏈核酸序列，從而與膠體金上標記的第三段序列和檢測線上劃的第四段序列形成夾心結構，使檢測線顯紅色。同時，質控線也呈現均一的紅色，說明生物傳感器的體系正常，結果可信。權利要求
1.一種用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于包括兩部分 (1)用于檢測銅離子的核酸納米金生物試紙條，由從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙組成； (2)上樣緩沖液體系，由核酸序列SEQID NO T2和核酸雜交液組成； 其中，所述玻璃纖維上涂有納米金標記的核酸序列，如SEQ ID N0:3所示； 所述硝酸纖維素膜上有質控線和檢測線，質控線上固定有用生物素標記并與鏈霉親和素反應后的核酸序列，如SEQ ID NO :5所示；所述檢測線上固定有用生物素標記并與鏈霉親和素反應后的核酸序列，如SEQ ID NO 4所示。
2.根據權利要求I所述的用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述SEQ ID NO :3的5’端用巰基修飾，所述SEQ ID NO :4的5’端和SEQ ID NO :5的3’端用生物素修飾。
3.根據權利要求I所述的用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述質控線和檢測線之間的距離為3 10mm。
4.根據權利要求I所述的用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙兩兩之間的相鄰部分彼此重疊f5mm。
5.根據權利要求I所述的用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述膠體金的粒徑為8 lOOnm。
6.權利要求f5中任意一條權利要求所述用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于所述納米金標記核酸序列的方法是 (1)納米金的制備選用粒徑為flOOnm的膠體金顆粒，膠體金采用常規的氯金酸煮沸還原法制備，通過控制還原劑的量在0. oro. 05%以及攪拌速度在100(T50000rpm之間來控制顆粒粒徑； (2)納米金與核酸序列的偶聯與封閉老化將巰基修飾的核酸序列加入到1-10倍體積濃縮的納米金溶液中，混合標記l_48h，用牛血清白蛋白或PEG封閉多余的活性位點，其后加入氯化鈉和SDS使其終濃度分別至0. 15M和0. 01%，老化5 30h后，800(Tl6000rpm離心.2(T60min,棄上清，即獲得納米金標記的核酸探針。
7.根據權利要求6所述的中任意一條權利要求所述用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器的制備方法，其特征在于所述樣品墊是經過以下處理的采用含表面活性劑、電中性或堿性緩沖液、PEG4000、BSA和蔗糖的混合液浸泡玻璃纖維4h后，37°C烘干過夜。
8.權利要求1飛中任意一條權利要求所述核酸納米金生物傳感器的使用方法，其特征在于是將上樣緩沖液體系滴在樣品墊上，如果待測樣品中含有銅離子，則核酸酶會切斷與其互補的底物序列，釋放出相應的序列，這序列首先會經過樣品墊，與膠體金顆粒上標記的核酸序列發生互補反應，然后經過檢測線，同樣與檢測線上標記的第四段核酸序列發生互補反應，膠體金顆粒停留在檢測線上，從而使得檢測線顯紅色；反應物繼續經過質控線，剩余沒有反應的膠體金顆粒，其上標記的序列與質控線上標記的核酸序列發生互補反應，使得質控線顯紅色，為陽性結果； 如果待測樣品中沒有銅離子，則核酸酶不會切斷其互補的底物序列，上樣后，由于底物序列被與其互補的酶序列占據，不會與膠體金顆粒上標記的序列發生反應，檢測線不顯色，但膠體金顆粒上標記的序列仍然能與質控線上的序列發生反應，質控線顯紅色，為陰性結果; 如果質控線不顯色，不管檢測線顯色與否，為無效結果。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測銅離子的核酸納米金生物傳感器。本發明所述的核酸納米金生物傳感器是通過銅離子存在時，針對銅離子的特異的核酸酶能夠切斷與它互補的底物這一原理，配合膠體金放大系統，用于檢測銅離子。本發明所述的核酸納米金生物傳感器具有高靈敏度、低費用、不需要使用任何儀器的優點，既解決了以往檢測方法中需要大型儀器的缺陷，又能保證檢測靈敏度，而且制備簡便，檢測迅速，不需要專業的技術人員。
文檔編號C12Q1/68GK102634571SQ20111031411
公開日2012年8月15日 申請日期2011年10月17日 優先權日2011年10月17日
發明者張文娟, 方志遠, 曾令文, 黃婧 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院