專利名稱：源自rhbdd1的蛋白及其在制備用于檢測結直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及源自RHBDDl的蛋白及其在制備用于檢測結直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體中的用途。
背景技術：
一般來說，多跨膜蛋白在進化中并不是特別保守，但是Tatusov RL等在搜索 Clusters of Orthlologous Groups of proteins (COGs)數據庫時發現了唯一的一個非常保守的蛋白家族，即Miomboid蛋白家族。該家族是近年來才發現的，已經在古生菌、細菌、 酵母菌、蜾蠅、哺乳動物，包括人，甚至植物等生物中發現了 Miomboid蛋白同源物。這是一類能夠切割單一跨膜蛋白跨膜結構域的絲氨酸蛋白酶。第一個Rhomboid 蛋白是 Christiane Nusslein-Volhard 和 Eric Wieschaus 在遺傳掃描(genetic screens)中通過突變發現的，并因此獲得了 1995年諾貝爾獎。他們發現該基因突變的蜾蠅胚胎有著Miomboid形的頭，即菱形的頭。Miomboid基因是相關于蜾蠅胚胎中腹外側位置信息的四個基因之一，這也是Miomboid蛋白家族的典型，涉及表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導通路的調節蛋白。直到最近，已經發現的Iihomboid家族蛋白約有100種，它們均進化保守，廣泛地存在于各種生物中。但是其序列同源性比較低，只是具有保守的Miomboid結構域。如此保守的蛋白質在數萬年的進化過程中保存下來，肯定有其重要的作用。盡管目前人們對這個家族蛋白的認識還很膚淺，只是集中在果蠅中的一些了解，但是從這些初步的結果以及其逐漸體現出的獨特作用來看，如果進一步深入研究這些蛋白質的功能將有助于我們認識關于細胞之間信息傳導的詳細機制。Rhomboid家族蛋白的表達受調控，而且催化底物具有特異性，這可能暗示這些蛋白質在某些重要組織中有作用。它既體現了類似于一些管家蛋白的保守性，卻沒有管家蛋白的表達普遍性，又體現了類似于組織細胞特異表達蛋白的特異性，卻又有著代表一類蛋白的保守性；所以，它們可能在一些對于生物發育成長重要的事件中發揮重要作用。RHBDDl是發明人所在實驗室從睪丸抑制性消減雜交文庫中篩選出的一個在睪丸組織中高表達的新基因(GenBank登錄號AY640233)。該基因在人中表達全長為315個氨基酸，含有四個跨膜結構域，其215-315位氨基酸為一段高度親水區。蛋白結構域分析表明，在其61-214位氨基酸含有一個高度保守的lihomboid結構域，故該蛋白屬于lihomboid 蛋白酶家族的新成員。實驗室前期對RHBDDl的功能進行了較為深入的研究，包括發現 RHBDDl通過特異性切割并降解促凋亡蛋白質BIK而發揮抑制凋亡的作用(Cellular and Molecular LifeSciences 65 =3822-9,2008)；應用自己建立并完善的小鼠精子發生重塑模型觀察RHBDDl對精子發生的影響，結果發現RHBDDl基因敲減后明顯抑制GC-I細胞的分化發育(BMC Cell BiollO :25，1-7，2009) ；RHBDDl可以特異性切割腫瘤抑制子活化通路蛋白 6(TSAP6)，進而參與調節TSAP6介導的外體分泌過程(文章在投稿中)；此外，發現RHBDDl具有特異性的促進AP-I信號通路的作用，可能在促進細胞周期、癌癥發生中發揮特定作用。
發明內容
本發明的目的是基于RHBDDl的功能研究提供RHBDDl在制備臨床診斷試劑或治療試劑方面的用途。本發明提供了源自RHBDDl的蛋白在制備用于檢測直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體中的用途，主要為將RHBDDl的215-315位氨基酸作為抗原表位，制備單克隆抗體，該單克隆抗體即為用于檢測直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體，RHBDDl的215-315位氨基酸的序列如 SEQ ID NO 1 所示。較佳地，所述制備單克隆抗體的方法為雜交瘤技術制備單克隆抗體。
雜交瘤技術制備單克隆抗體的主要步驟可以包括
(1)抗原制備；
(2)免疫動物；
(3)免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備；
(4)細胞融合；
(5)雜交瘤細胞的選擇培養；
(6)雜交瘤細胞的篩選；
(7)雜交瘤細胞的克隆化；
(8)單克隆抗體的檢定；
(9)分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立；
(10)單克隆抗體的大量制備。
較佳地，通過構建原核表達質粒并進行大腸桿菌原核表達純化的方法進行抗原制合。
單克隆抗體的大量制備可以采用動物體內誘生法或體外培養法。
相應地，源自RHBDDl的215-315位氨基酸的蛋白(序列如SEQ ID NO :1所示)及
其基因和將其作為抗原制備的單克隆抗體也都是本發明的一部分。本發明基于RHBDDl的功能研究提供了其在制備臨床診斷試劑方面的用途。本發明為結直腸癌或乳腺癌的臨床診斷提供了輔助檢測手段，其利用RHBDDl在結直腸癌和乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織作為判斷依據，為RHBDDl的應用做出了有益的探索。
圖1為大腸桿菌表達純化的抗原蛋白(RHBDD1的215-315位氨基酸)的凝膠電泳圖；圖2-1和圖2-2分別為獲得兩株特異性高的單克隆抗體細胞株沈號和30號的抗體特異性檢測結果；圖3為沈號抗體Wfestern blot檢測結直腸癌病人的癌與癌旁中RHBDDl的表達情況的結果；
圖4-1和圖4-2分別為通過組織芯片技術檢測RHBDDl在結直腸癌和癌旁組織中的表達情況的檢測結果；圖5為從芯片結果中各選取兩例結腸癌和兩例直腸癌的拍照結果；圖6為RHBDDl的RNA干擾穩定細胞株(兩個靶點)的鑒定結果如圖；圖7為RHBDDl的RNA干擾穩定細胞株測定的細胞生長情況的生長曲線；圖8-1和圖8-2表示了 RHBDDl的RNA干擾穩定細胞株克隆形成實驗檢測的細胞生長情況；圖9為通過體細胞基因敲入技術制備RHBDDl內源活性位點突變失活的結直腸癌細胞株HCTl 16和RKO的鑒定結果；圖10-1和圖10-2分別為通過體細胞基因敲入技術制備RHBDDl內源活性位點突變失活的結直腸癌細胞株HCT116和RKO的細胞生長情況的生長曲線；圖11-1和圖11-2分別為通過體細胞基因敲入技術制備RHBDDl內源活性位點突變失活的結直腸癌細胞株HCT116和RKO的克隆形成實驗檢測的細胞生長情況；圖12-1和圖12-2分別為通過體細胞基因敲入技術制備RHBDDl內源活性位點突變失活的結直腸癌細胞株HCT116和RKO的軟瓊脂集落形成實驗的結果；圖13表示了微波加熱修復(pH 6修復液)條件下RHBDDl的免疫組化染色結果 (人結腸癌)(100X)；圖14-1到圖14-8表示了 RHBDDl在不同樣本中的表達水平，依次為陰性對照 (40X)、陽性對照(40X)、弱陽性(100X)、弱陽性(200X)、中等陽性(100X)、中等陽性 OOOX)、強陽性(100X)和強陽性QOOX)；圖15-1和圖15-2為RHBDDl在癌旁正常乳腺組織中的表達情況，分別為陰性 (100X)和弱陽性(100X)的情況；；圖16表示了不同RHBDDl表達程度患者的Kaplan-Meier生存曲線(比較陰性、弱陽性、中等陽性和強陽性)；圖17表示了不同RHBDDl表達程度患者的Kaplan-Meier生存曲線(比較陰性和陽性)。
具體實施例方式下面進一步說明本發明的具體實施方式
。首先是利用雜交瘤技術制備小鼠單克隆抗體，制備流程的主要步驟包括(1)抗原制備；(2)免疫動物；(3)免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備；(4)細胞融合；(5)雜交瘤細胞的選擇培養；(6)雜交瘤細胞的篩選；(7)雜交瘤細胞的克隆化；(8)單克隆抗體的檢定；(9)分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立；
(10)單克隆抗體的大量制備。下面簡要介紹單克隆抗體的制備過程1)、免疫動物免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產生致敏B淋巴細胞的過程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。抗原通過血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。2)、細胞融合采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。3)、選擇性培養選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養基中存活和增殖。4)、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養基中生長的雜交瘤細胞，只有少數是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。5)、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備采用動物體內誘生法或體外培養法。(1)體內誘生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0. 5ml液體石臘或降植烷進行預處理。1-2周后，腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，并產生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。( 體外培養法將雜交瘤細胞置于培養瓶中進行培養。在培養過程中，雜交瘤細胞產生并分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量有限。近年來，各種新型培養技術和裝置不斷出現，大大提高了抗體的生產量。其中，制備過程中的關鍵性數據結果如下1) RHBDDl全長315個氨基酸，我們通過親疏水性分析和抗原表位預測后，選擇 215-315位氨基酸(依次對應于SEQ ID NO=I所示序列的1-101位氨基酸)作為抗原表位，構建原核表達質粒并進行大腸桿菌原核表達純化，蛋白純化結果如圖1所示，得到的 RHBDDl融合表達蛋白的純度較高(> 90% )，可用于制備單克隆抗體。2)制備RHBDDl的小鼠單克隆抗體，并獲得兩株特異性高的單克隆抗體細胞株沈號和30號，抗體特異性檢測結果分別如圖2-1和圖2-2所示(wt 野生型；mt 突變型)，都處于34kDa與^kDa之間，鄰近34kDa。獲得的26號和30號RHBDDl小鼠單克隆抗體的特異性好，效價高。
下面為一部分檢測結果1.使用沈號抗體^festern blot檢測結直腸癌病人的癌與癌旁中RHBDDl的表達情況，檢測結果如圖3所示，RHBDDl在結直腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。2.通過組織芯片技術檢測RHBDDl在結直腸癌和癌旁組織中的表達情況，71例結腸癌的檢測結果如圖4-1所示，71例直腸癌的檢測結果如圖4-2所示。從芯片結果中各選取兩例結腸癌和兩例直腸癌拍照結果如圖5所示，可以看出， RHBDDl在癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。3.制備了 RHBDDl的RNA干擾穩定細胞株(兩個靶點)，鑒定結果如圖6所示。兩個靶點的RNA干擾效果均大于80%。生長曲線測定細胞生長情況如圖7所示，RHBDDl表達受到抑制后細胞的生長明顯減慢。克隆形成實驗檢測細胞生長情況如圖8-1和圖8-2所示。RHBDDl表達受到抑制后細胞克隆的生長明顯減慢。4.通過體細胞基因敲入技術制備RHBDDl內源活性位點突變失活的結直腸癌細胞株HCT116和RK0，鑒定結果如圖9所示，RHBDDl活性位點的內源突變使該蛋白質結構改變并被體內降解，因此在蛋白質水平檢測不到RHBDDl的表達，相當于RHBDDl的基因敲入細胞。生長曲線測定細胞生長情況如圖10-1和圖10-2所示，在HCTl 16和RKO細胞中， 內源RHBDDl的突變失活使細胞的生長明顯減慢。克隆形成實驗檢測細胞生長情況如圖11-1和圖11-2所示，在HCTl 16和RKO細胞中，內源RHBDDl的突變失活導致細胞克隆的生長明顯減慢。軟瓊脂集落形成實驗的結果如圖12-1和圖12-2所示，在HCT116和RKO細胞中， 內源RHBDDl的突變失活導致細胞在軟瓊脂中生長緩慢。總結本發明選擇RHBDDl的215-315位氨基酸作為抗原進行原核表達純化，再通過雜交瘤技術制備并得到26#和30#兩株特異性較高的雜交瘤細胞株。進一步使用該細胞株進行小鼠腹腔免疫，收腹水并純化得到RHBDDl的小鼠單克隆抗體。使用該抗體檢測腫瘤組織表達情況(包括結直腸癌和乳腺癌等)，發現RHBDDl在結直腸癌和乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。這一臨床檢測結果提示RHBDDl在腫瘤發生和發展過程中可能具有重要作用，并且該蛋白在腫瘤中的表達檢測可以成為臨床診斷的輔助檢測手段，這些研究結果為RHBDDl的開發應用打下了堅實的基礎。本發明的理論基礎是RHBDDl在結直腸癌和乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。下面通過RHBDDl免疫組化染色實驗來驗證該理論基礎。一、RHBDD1免疫組化染色條件選取較新鮮的人結腸癌石蠟標本，切片，抗原修復法分別采用微波熱修復(酸性修復液和堿性修復液)、高壓熱修復、胰酶修復、不修復，結果顯示各修復方法均有染色，相比較而言，微波熱修復(酸性修復液)染色效果最佳。堿性修復液及高壓熱修復方法可造成少部分細胞核異位染色，胰酶修復與不修復條件下染色偏淺。后續實驗抗原修復條件均采用微波熱修復、酸性修復液(檸檬酸緩沖液pH 6. 0)。圖13表示了微波加熱修復(pH 6修復液)條件下RHBDDl的免疫組化染色結果(人結腸癌)(100X)二、RHBDDl在浸潤性乳腺癌中的表達1. RHBDDl在浸潤性乳腺癌中的表達水平RHBDDl在浸潤性乳腺癌中陽性表達為35例，陰性22例，陽性者其中3例為強陽性，4例為中等陽性，28例為弱陽性。陽性率61. 4%。圖14-1到圖14-8表示了 RHBDDl在不同樣本中的表達水平，依次為陰性對照 (40X)、陽性對照(40X)、弱陽性(100X)、弱陽性(200X)、中等陽性(100X)、中等陽性 O00X)、強陽性(100X)和強陽性O00X)。陰性對照為一抗孵育環節僅加入一抗稀釋液， 作為空白對照；陽性對照為明確證實P53陽性的人浸潤性乳腺導管癌標本，作為實驗方法對照。RHBDDl抗體的稀釋倍比均為1 200。2. RHBDDl在不同類型的浸潤性乳腺癌中的表達如表1所示，在27例浸潤性乳腺導管癌中，RHBDDl陰性6例，弱陽性18例，中等陽性3例。在27例浸潤性乳腺小葉癌中，RHBDDl陰性13例，弱陽性10例，中等陽性1例， 強陽性3例。3例浸潤性導管癌合并小葉癌中，RHBDDl染色均為陰性。比較RHBDDl在不同病理類型中的陽性率，浸潤性導管癌中為77. 8%，浸潤性小葉癌中為51. 8%，經Pearson卡方檢驗，此兩者差異具有統計學意義。(X2 = 3. 979,ρ = 0. 046)表1RHBDD1在不同病理類型的乳腺癌中的表達差異
權利要求
1.源自RHBDDl的蛋白在制備用于檢測直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體中的用途，其特征在于，將RHBDDl的215-315位氨基酸作為抗原表位，制備單克隆抗體，該單克隆抗體即為用于檢測直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體，RHBDDl的215-315位氨基酸的序列如SEQ IDNO 1所示。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述制備單克隆抗體的方法為雜交瘤技術制備單克隆抗體。
3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于，雜交瘤技術制備單克隆抗體的主要步驟包括(1)抗原制備；(2)免疫動物；(3)免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備；(4)細胞融合；(5)雜交瘤細胞的選擇培養；(6)雜交瘤細胞的篩選；(7)雜交瘤細胞的克隆化；(8)單克隆抗體的檢定；(9)分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立；(10)單克隆抗體的大量制備。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于，通過構建原核表達質粒并進行大腸桿菌原核表達純化的方法進行抗原制備。
5.根據權利要求3所述的用途，其特征在于，單克隆抗體的大量制備采用動物體內誘生法或體外培養法。
6.一種源自RHBDDl的蛋白，其特征在于，該源自RHBDDl的蛋白的氨基酸序列為如SEQ ID NO 1所示的RHBDDl的215-315位氨基酸。
7.編碼權利要求6所述的源自RHBDDl的蛋白的基因。
8.利用權利要求6所述的源自RHBDDl的蛋白作為抗原制備的單克隆抗體。
全文摘要
本發明提供了一種源自RHBDD1的蛋白，該蛋白的氨基酸序列為RHBDD1的215-315位氨基酸。本發明還提供了所述源自RHBDD1的蛋白在制備用于檢測直腸癌或乳腺癌的單克隆抗體中的用途，該用途主要為利用所述源自RHBDD1的蛋白作為抗原，通過雜交瘤技術制備并得到雜交瘤細胞株，進一步使用該雜交瘤細胞株進行小鼠腹腔免疫，收腹水并純化得到RHBDD1的小鼠單克隆抗體，該小鼠單克隆抗體即為用于檢測直腸癌或乳腺癌的抗體。利用本發明獲得的所述單克隆抗體為結直腸癌或乳腺癌的臨床診斷提供了輔助檢測手段，其利用RHBDD1在結直腸癌和乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織作為判斷依據進行輔助診斷。
文檔編號C12N5/20GK102358754SQ20111031076
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月14日 優先權日2011年10月14日
發明者宋偉 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所