專利名稱：雞馬立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株，其構建方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種由于基因缺失得到的弱毒疫苗株，尤其涉及雞馬立克氏病病毒 Meq基因缺失疫苗株，還涉及其在制備防治雞馬立克氏病藥物中的應用，屬于生物醫藥領域。
背景技術：
雞馬立克氏病(MD，Marek' s Disease)是由感染馬立克病毒(MDV，Marek' s Disease virus)引起的，是一種嚴重危害養禽業發展的高度傳染性、腫瘤性疾病。該病可引起雞發生多發性淋巴瘤，導致雞只衰竭、死亡。同時損傷雞體的免疫器官，產生嚴重的免疫抑制，易并發其他疾病。該病病程較長，并且發生該病后常導致整個雞群的淘汰，一旦發生該病，損失往往特別巨大。疫苗是控制該病的主要手段，在種雞群、蛋雞群中MD疫苗是必須使用的疫苗，肉雞群中使用該疫苗可以較大幅度地提高養殖效率。MD的病原-馬立克氏病毒(MDV)毒力呈不斷演化的趨勢。近些年，隨著MDV更強毒力毒株的出現，尤其是特超強毒的出現，現有的疫苗毒株，包括廣泛應用的HVT、CVI988疫苗株不能對其進行良好的保護。 在我國不同地區的養雞場中，MD疫苗免疫雞群常有MD的發生。最近的報道表明，即使應用最新型的MDV疫苗，一些MDV強毒株也能引起免疫雞群發生接近50%的MD死亡率。我們研究組最近幾年連續從現地MD免疫失敗的養雞場分離到20多株MDV強毒株，對其中部分毒株的免疫攻毒試驗表明，有些毒株可以突破HVT疫苗、HVT+SB1雙價疫苗以及血清1型的CVI988疫苗的免疫保護，證明我國流行的MDV野毒的毒力在逐步的提高， 現有的所有MD疫苗均不能提供有效保護。因此，迫切需要研制新的MD疫苗毒株，以便有效防控MDV。MDV缺失某一基因后致腫瘤性喪失，而它的復制能力沒有被破壞，以這種病毒研制的MD疫苗，它的免疫保護能力將非常高。近幾年MDV功能基因的研究進展很快，Jarosinski 等缺失MDV RBlB株細菌人工染色體(BAC)的RL0RF4基因，發現缺失后的RBIB株在體內外的毒力減弱；Silva等將Md5株的2拷貝132bp重復序列缺失，與親本病毒以相同方式接種SPF雞，也無毒力減弱趨勢。Reddy課題組為了研究Meq基因功能，將Md5株的Meq基因去除，構建了一株Meq基因缺失株rMd5AMeq。缺失株在體外生長穩定，同時也證明了 Meq 基因在淋巴細胞感染期是非必需的。其免疫保護效果強于現用商業化疫苗株CVI988，無論是實驗室人工攻毒試驗還是模擬田間試驗，都能誘發高水平的免疫反應，能夠抵抗Md5 (vv) 和648A(w+)的攻擊。針對不同增殖能力的野毒株缺失Meq基因有很高的研究價值。目前重組MDV的構建多采用BAC技術-是將BAC載體插入至病毒基因組非必需位點，構建病毒感染性克隆。該方法也存在一些缺點，一是在病毒基因組中插入了外源基因 (BAC成分)，存在潛在的不利因素。二是病毒基因組在操作過程中，需要在原核細胞中增殖和擴增。由于MDV病毒基因組很大，在原核系統中增殖更易導致基因突變。本研究是在分析近年來本實驗室從現地分離到的多株MDV流行毒株的生物學特性的基礎上，選擇MDV MS株為親本毒株，采用基因工程手段，通過兩次同源重組的方法獲得了重組病毒株-rMSAMeq。該構建重組病毒的方法避免了采用BAC技術帶來的一些不利影響。該毒株對雞具有良好的安全性；以該毒株免疫接種雞，可以提供高效的抗MDV免疫保護作用。該疫苗株的另外一個重要特點是帶有基因缺失的遺傳標記，可以據此區分疫苗毒株和野生毒株，有利于雞群的MDV感染檢測和免疫監控。同時，該基因缺失疫苗株也具有制備以其為活病毒載體構建表達其他外源蛋白的重組病毒的用途。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有弱毒疫苗的不足，提供一種可以有效預防雞馬立克氏病，并具有分子標記，利于免疫雞群的野毒感染和免疫監控的新的雞馬立克氏病基因缺失疫苗株。用該疫苗株所制備的疫苗對目前我國流行的雞馬立克氏病病毒可以提供良好的免疫保護效果。本發明所要解決的技術問題之一是提供了一種構建雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，本發明的方法其特征在于所述的Meq基因缺失疫苗株是在親本毒株 MDV MS株的基礎上經兩次同源重組得到的，第一次同源重組是在親本毒株MDV MS株的基礎上通過插入報告基因IacZ并同時替換主要致瘤基因Meq基因的前半部分的468bp的堿基序列得到中間體病毒株；后經第二次同源重組去掉中間體病毒株中插入的報告基因，即得所述的Meq基因缺失疫苗株，所述的Meq基因的前半部分468bp的堿基序列如SEQ ID NO. 1 所示。在本發明的一個具體實施例中，構建雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，具體的包括以下步驟(1)轉移載體的構建參照已發表的MDV強毒GA株相關基因序列，GeneBank登錄號為No. AF147806，針對Meq基因兩側的片段A、B分別設計了引物對I^rimer A和I^rimer B，片段A、B作為構建轉移載體質粒的同源序列；所述的引物對Primer A和Primer B序列如下所示Primer A 上游引物5 ‘CCGGCATGCGCCCTCCGTATAATGTAAAT 3，下游引物5 ‘GTCGACTGCCCGCCTTCTCCCTGGTAT 3，Primer B 上游引物5 ‘GTCGACACTCCTCCACCTCCCTCAC 3，下游引物5 ‘GCGAGCTCGAATGTCCATCCTGTTATCT 3，以MDV MS株基因組DNA為模板，通過PCR方法獲得Meq基因片段A，經Ml I和 Sph I酶切，與pUC19連接，得到質粒pUCA ；PCR擴增得到Meq基因片段B,經Sal I和Sac I酶切后，連接到PUCA中，得到質粒pUCAB ；經Mil酶切得到的LacZ表達基因盒，連接到 pUCAB質粒中，得到質粒pALadB ；(2)第一次同源重組MDV MS株基因組總DNA與轉移載體質粒pALadB共轉染雞胚成纖維細胞，在親本毒株MS株的基礎上通過插入報告基因IacZ并同時替換主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp的堿基序列得到雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失中間體病毒株，所述的Meq基因的前半部分468bp的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示；(3)第二次同源重組采用經第一次同源重組得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失中間體病毒株的基因組總DNA與轉移載體質粒pUCAB共轉染雞胚成纖維細胞，篩選得到去掉中間體病毒株中插入的報告基因的Meq基因缺失疫苗株，即得所述的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。其中所述的親本毒株MDV MS株(參見文獻馬立克氏病病毒miRNA缺失株的構建及其體外生長規律，楊文闖、劉長軍等，中國獸醫科學.2011,41 (03))由哈爾濱獸醫研究所禽傳染病研究室保存提供。)該毒株的特點是(1)對雞具有較高致病性；( 在雞體內、外的增殖能力強；C3)感染雞只后，雞只發病時間早。本發明所要解決的技術問題之二是提供了由所述的方法制備得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。及由所述的方法制備得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失中間體病毒株。通過本發明的具體實施例得到了一株所述的基因缺失疫苗株，命名為rMSAMeq， 建議的分類命名為禽皰疹病毒2型(Gallid herpesvirus 2)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其微生物保藏編號是CGMCCNo. 4612。地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，保藏日期為2011年2月M日。本發明所要解決的技術問題之三是提供了所述的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株在制備防治雞馬立克氏病藥物中的用途。本發明所要解決的技術問題之四提供了是一種疫苗組合物，其特征在于由所述的 Meq基因缺失疫苗株及藥學上接受的載體或佐劑組成。本發明所要解決的技術問題之五是提供了一種用于區分本發明所述的基因缺失疫苗株和馬立克氏病毒野毒株的方法，其特征在于以SEQ ID NO. 1所示的序列作為模板序列，通過設計引物進行PCR擴增檢測。優選的，所述的引物對序列如下所示5 iGGGAAATGACAGGTGAATTGTG 3’5 iGCAGGAAAATTTGTTACCCCAG 3’本發明中的雞馬立克氏病基因缺失疫苗株的構建策略及技術特點首先，本研究采用兩次重組技術進行構建。構建策略是首先應用報告基因替換掉目標缺失序列，然后再缺失掉報告基因。這種方法的優點在于在病毒基因組缺失掉目的基因的操作過程中，沒有引入任何其他的外源基因序列，避免了由于外源基因片段的插入帶來的負面影響。同時整個操作過程都是在真核系統下進行的，可有效提高對病毒基因組的保真性。這兩方面特點， 對構建MDV的基因缺失疫苗都是非常有利的。其次，對于缺失片段的選擇上，選擇對主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp的堿基序列進行重組缺失。這是因為Meq基因的開放閱讀框架(ORF)與一個編碼23KD蛋白的ORF具有部分反向重疊，為了不影響該23KD蛋白的表達，僅缺失了 Meq基因ORF的前半部分468bp的堿基序列，破壞其0RF，而又不影響其他的基因結構。本發明獲得的雞馬立克基因缺失疫苗株，可穩定遺傳、對雞無致病性，并可作為疫苗對MDV超強毒的攻擊提供有效的免疫保護作用。在制備防治雞馬立克氏病疫苗中有廣泛的用途。另外，本發明中的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株以及表達LacZ基因的缺失Meq基因的雞馬立克氏病基因缺失中間體病毒株，可作為活疫苗病毒載體表達其他外源蛋白。由于LacZ基因己經完全插入到雞馬立克氏病基因缺失中間體病毒株的基因組中，并能夠持續表達該蛋白，LacZ基因可以直接作為反向篩選的標記，采用同源重組、基因替換的方法，插入其他外源基因，表達其他病源的蛋白，對于研制其它禽病的疫苗有較大的應用價值。因此，本發明所要解決的再一個技術問題是提供了雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株或表達LacZ基因的缺失Meq基因的雞馬立克氏病基因缺失中間體病毒株在做為活病毒載體構建表達其他外源蛋白的重組病毒中的用途。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的本發明的缺失MDV Meq基因雙拷貝的重組MDV方案由以下組分組成重組病毒轉移質粒構建、磷酸鈣轉染法進行同源重組、重組病毒蝕斑篩選純化、重組病毒鑒定及生物學特性分析。本發明中缺失MDV Meq基因雙拷貝的疫苗株制備，包括以下步驟1、重組病毒轉移載體質粒構建設計并合成用于擴增同源臂和重組病毒鑒定引物，通過PCR方法獲得Meq基因缺失位置的上、下游同源臂A、B片段后，將A片段和B片段依次克隆至pUC19質粒中，得到質粒 pUC-AB,將LacZ表達盒連接至陽性質粒pUC_AB中，經PCR和酶切鑒定，得到質粒pALacZB。 由此構建得到了 2個轉移載體質粒pUC-AB、pALacZB，用于構建重組病毒。2、磷酸鈣轉染法進行同源重組MDV MS株基因組總DNA與轉移載體質粒DNA用磷酸鈣沉淀法共轉染雞胚成纖維細胞(CEF)。具體方法如下將長成單層的CEF，消化后傳代至細胞培養皿。于無菌1. 5mL離心管中加入去離子水、MS株感染的CEF基因組總DNA、質粒pALacZB、TE緩沖液、2mol -L^1CaCl2 混勻后，再緩緩加入2XHEPES，孵育30min包裝成細小顆粒后，重懸，加入到制備好的CEF次代細胞，培養池后，進行休克處理。培養至出現MDV典型蝕斑后，進行蝕斑克隆和純化。3、重組病毒蝕斑篩選純化用磷酸鈣沉淀法共轉染CEF，培養至出現MDV典型蝕斑后，加入X-Gal，進行藍白斑篩選。選擇藍色蝕斑進行克隆純化，經10輪蝕斑純化，最終形成的蝕斑全部為藍色。經測序鑒定正確病毒，純化后命名為rMS-LaCZAMeq。在此基礎上進行第二次重組去掉LacZ， 命名為rMSAMeq。4、重組病毒鑒定按常規方法提取rMS Δ Meq感染CEF總DNA，用引物LadB進行鑒定，MS株不能擴增出結果，rMSAMeq株擴增結果與預期相符，證明了 LacZ重組的位置正確。用引物ALB鑒定，親本MS株擴增大小為656bp，重組rMS AMeq約4400bp，與預期相符。從而證明重組病毒rMS Δ Meq的兩個Meq基因均已缺失。5、生物學特性分析5. 1遺傳穩定性在相同的培養條件下，分別培養親本病毒MS株和重組病毒rMS Δ Meq株，顯微鏡下觀察2毒株體外生長特性，觀察主要指標有蝕斑大小、折光性、形狀和形態的變化情況。純化后的重組毒在CEF上連續繼傳10代，每一代次均用X-Gal染色，觀察蝕斑是否均為藍色。 在病毒傳代至5和10代時，用檢測引物進行PCR檢測，檢測重組病毒rMS ΔMeq的兩個Meq 基因是否已缺失。
5. 2增殖特性為分析病毒在體內外的增殖特性，將親本病毒MS株和重組病毒rMSAMeq株分別接種SPF雞及CEF，24孔細胞培養板每孔10PFU，SPF雞2000PFU/只，，接種的細胞分別于接種后1、2、3、4、5和7d后收集細胞，SPF雞于接種后1、2、3、4、6周，采集羽髓，提取羽髓，提取細胞及羽髓DNA，進行實時熒光定量PCR檢測羽髓中的病毒含量，繪制病毒生長的動力學曲線，分析病毒的生長規律。5. 3對雞的致病性將SPF雞隨機分成兩組，第一組腹腔接種重組病毒rMS Δ Meq每只20000PFU，第二組接種等量0. 2mL PBS作為陰性對照。接種后每天觀察雞的精神狀態和有無馬立克氏病臨床癥狀，15周齡后全部剖殺，觀察實驗雞只有無MD癥狀皮膚、坐骨神經、腺胃、肝臟、腎臟、 脾、法式囊、胸腺等組織有無病變，并將分離組織進行病理學檢測。5. 4抗馬立克氏病病毒免疫原性分析分析該重組病毒的免疫原性，將其與國內疫苗株814株進行攻毒保護實驗分析， 即將重組病毒rMS Δ Meq與814毒株接種1日齡SPF雞，接種后7天接種超強毒Md5進行攻毒，每天觀察并記錄實驗雞只臨床癥狀、死亡情況及實驗期內雞只的體重變化情況，并計算疫苗保護指數。
圖1為本發明提供的載體質粒pALadB示意圖；圖2為本發明提供的質粒pALadB酶切鑒定結果；圖3為本發明提供的重組病毒rMS-LacZ AMeq在CEF上的蝕斑染色結果；圖4為本發明提供的重組病毒rMS-LacZ AMeq的Meq基因缺失的PCR鑒定結果；圖5為本發明提供的重組病毒基因組Meq基因拷貝數PCR鑒定結果；圖6為本發明提供的重組病毒rMS Δ Meq及親本病毒的Meq基因PCR鑒定結果；圖7為本發明提供的親本毒MS與重組毒株rMS在CEF上生長曲線檢測結果；圖8為本發明提供的重組病毒在雞羽髓中的復制能力的實時熒光定量PCR檢測結果；圖9為本發明提供的重組病毒免疫保護效率試驗結果。
具體實施例方式以下通過實施例進一步闡明本發明的有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的范圍。實施例1重組病毒轉移質粒構建1、試驗材料MDV MS株(參見文獻馬立克氏病毒miRNA缺失株的構建及其體外生長規律，楊文闖、劉長軍等，中國獸醫科學.2011，41(03))、MDVMd5(參見文獻馬立克病毒超強毒株(Md5、RB1B)毒力試驗，甘軍紀劉秀梵吳長新，中國畜牧獸醫學會禽病學分會第十一次學術研討會論文集.2002)、雞馬立克病病毒814株(參見文獻雞馬立克病病毒814 株gE、gI、gp82基因的克隆及序列分析.張艷萍，劉長軍等.動物科學進展，2007 (3))由哈爾濱獸醫研究所禽傳染病研究室保存，提供；無特定病原體(SPF)雞胚、雞由哈爾濱獸醫研究所動物中心提供；大腸桿菌DH5 α為哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心保存。PUC19購買自TaKaRa (大連)公司。2、試驗方法1)引物的設計與合成參照已發表的MDV強毒GA株相關基因序列(No. AF147806)，分別設計了引物對I^rimer A和I^rimer B，針對Meq基因兩側的片段A、B作為構建轉移載體質粒的同源序列。引物對LacZB的上游在LacZ基因上，下游在重組臂B上， 用于鑒定是否重組；引物對ALB的上游在重組臂A上，下游在重組臂B上，用于鑒定缺失位置與個數。若引物ALB擴增大小若為660bp，表明Meq基因沒有缺失，若擴增大小為4288bp 表明LacZ插入預定位置；引物Meq的上游、下游分別位于Meq基因的兩側，用于重組載體 rMS-LacZAMeq的PCR鑒定，對于親本病毒MS株的檢測，由于meq基因完整，因此擴增片段大小約為1.4Kb，對于重組毒株rMSΔMeq其缺失了 468bp(SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列， 缺失的雞馬立克氏病毒Meq基因核苷酸序列，具體如下5 ‘CGGTACAGGTGTAAAGAGATGTCTCAG GAGCCAGAGCCGGGCGCTATGCCCTACAGTCCCGCTGACGATCCGTCCCCCCTCGATCTTTCTCTCGGGTCGACTTCG AGACGGAAAAAAAGGAAAAGTCACGACATCCCCAACAGCCCCTCCAAACACCCCTTCCCTGACGGCCTATCTGAGGA GGAGAAACAGAAGCTGGAAAGGAGGAGAAAAAGGAATCGTGACGCCGCTCGGAGAAGACGCAGGGAGCAGACGTACT ATGTAGACAAACTCCATGAAGCATGTGAAGAGCTGCAGAGGGCCAATGAACACCTACGTAAGGAAATTCGAGATCTA AGGACTGAGTGCACGTCCCTGCGTGCACAGTTGGCTTGTCATGAGCCAGTTTGCCCTATGGCGGTACCCCTAACGGT GACCCTTGGACTGCTTACCGCCCCGCACGATCCCGTTCCTGAACCTCCCATTTGC 3，)，擴增結果約為 Ikb。 引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物名稱及序列如表1所示表1本發明提供的構建重組病毒的引物序列
權利要求
1.一種構建雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，其特征在于所述的Meq 基因缺失疫苗株是在親本毒株MDV MS株的基礎上經兩次同源重組得到的，第一次同源重組是在親本毒株MDV MS株的基礎上通過插入報告基因IacZ并同時替換主要致瘤基因Meq 基因的前半部分的468bp的堿基序列得到中間體病毒株；后經第二次同源重組去掉中間體病毒株中插入的報告基因，即得所述的Meq基因缺失疫苗株，所述的Meq基因的前半部分 468bp的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.如權利要求1所述的構建雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，其特征在于具體的包括以下步驟(1)轉移載體的構建參照已發表的MDV強毒GA株相關基因序列，GeneBank登錄號為No. AF147806，針對Meq 基因兩側的片段A、B分別設計了引物對ft~imer A和ft~imer B，片段A、B作為構建轉移載體質粒的同源序列；所述的引物對I^rimer A和I^rimer B序列如下所示 Primer A 上游引物5 ‘CCGGCATGCGCCCTCCGTATAATGTAAAT 3，下游引物5 ‘GTCGACTGCCCGCCTTCTCCCTGGTAT 3’ Primer B 上游引物5 ‘GTCGACACTCCTCCACCTCCCTCAC 3，下游引物5 ‘GCGAGCTCGAATGTCCATCCTGTTATCT 3’ 以MDV MS株基因組DNA為模板，通過PCR方法獲得Meq基因片段A，經Mil和Sph I 酶切，與PUC19連接，得到質粒pUCA ；PCR擴增得到Meq基因片段B，經Ml I和I酶切后，連接到PUCA中，得到質粒pUCAB ；經Mil酶切得到的LacZ表達基因盒，連接到pUCAB質粒中，得到質粒PALacZB ；(2)第一次同源重組MDVMS株基因組總DNA與轉移載體質粒pALadB共轉染雞胚成纖維細胞，在親本毒株MS株的基礎上通過插入報告基因IacZ并同時替換主要致瘤基因Meq 基因的前半部分468bp的堿基序列得到雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失中間體病毒株，所述的Meq基因的前半部分468bp的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示；(3)第二次同源重組采用經第一次同源重組得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失中間體病毒株的基因組總DNA與轉移載體質粒pUCAB共轉染雞胚成纖維細胞，篩選得到去掉中間體病毒株中插入的報告基因的Meq基因缺失疫苗株，即得所述的雞馬立克氏病病毒 Meq基因缺失疫苗株。
3.由權利要求1或2所述的方法制備得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。
4.如權利要求3所述的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株，其特征在于所述的 Meq基因缺失疫苗株為rMSAMeq，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其微生物保藏編號是CGMCC No. 4612。
5.如權利要求3或4所述的Meq基因缺失疫苗株在制備防治雞馬立克氏病藥物中的用途。
6.如權利要求3或4所述的Meq基因缺失疫苗株在制備以其為活病毒載體構建表達其他外源蛋白的重組病毒中的用途。
7.由權利要求1或2所述的方法制備得到的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失中間體病毒株。
8.如權利要求7所述的Meq基因缺失中間體病毒株在制備以其為活病毒載體構建表達其他外源蛋白的重組病毒中的用途。
9.一種疫苗組合物，其特征在于由有效量的權利要求3或4所述的基因缺失疫苗株及藥學上接受的載體或佐劑組成。
10.一種用于區分權利要求3或5所述的基因缺失疫苗株和馬立克氏病毒野毒株的方法，其特征在于以SEQ ID NO. 1所示的序列作為模板序列，通過設計引物進行PCR擴增檢測，優選的所述引物對序列如下所示 iGGGAAATGACAGGTGAATTGTG 3' 5 iGCAGGAAAATTTGTTACCCCAG 3’。
全文摘要
本發明公開了雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株、其構建方法及應用。本發明的雞馬立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株rMSΔMeq株，微生物保藏號是CGMCC No.4612，其是在親本毒株MDV MS株的基礎上，經兩次同源重組缺失主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp堿基序列而得到。本發明還涉及該基因缺失疫苗株在制備防治雞馬立克氏病藥物中的應用以及針對該基因缺失毒株的缺失基因序列研制的可用于區分疫苗毒株與雞馬立克氏病毒野毒株的檢測及診斷方法。本發明基因缺失疫苗株安全性好，對于雞馬立克氏病具有良好的免疫保護效力，可應用于制備防控雞馬立克氏病病毒的單苗或聯苗等。
文檔編號C12Q1/70GK102363769SQ20111030783
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月12日 優先權日2011年10月12日
發明者劉長軍, 張艷萍, 李志杰 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所