專利名稱：一種芥藍過氧化物酶的純化方法
技術領域：
本發明涉及一種芥藍過氧化物酶的純化方法，具體地，依次采用硫酸銨沉淀、疏水層析、離子交換色譜和凝膠電泳方法，簡潔地從植物蛋白粗提液中分離得到純化的過氧化物酶，屬于植物生物技術領域。
背景技術：
過氧化物酶催化H2O2或其他過氧化物來氧化多種底物，如多酚類、胺類化合物及某些雜環化合物，在醫學檢測、工業廢水處理、有機聚合物合成、生物傳感器等方面有廣泛的應用。過氧化物酶在植物中普遍存在，具有多種同功酶及不同的生理功能，如氧化分解吲哚乙酸、合成木質素、提高植物的抗逆性等。上述應用與生理功能研究的基礎在于得到純的過氧化物酶。目前，已從辣根、龍眼、大豆殼、沙棘等植物中分離得到過氧化物酶，主要是利用硫酸銨分級沉淀、離子交換、 分子篩過濾、疏水層析等方法。這些方法一般過程復雜，例如林琳等在分離龍眼果皮過氧化物酶時(林琳等.龍眼果皮過氧化物酶的分離純化.福建農林大學學報，2006，35 O) 157-160)采用硫酸銨鹽析分級、Streamline Pheneyl、DEAE-Cellose、Phenyl Sepharose High. Performance, Superdex 200prep grade等層析分離出4個過氧化物酶組分；此外大量同功酶的存在，例如在富士蘋果中有11個過氧化物酶同功酶(閆忠業等.富士系蘋果過氧化物酶同功酶研究.沈陽農業大學學報，2006，37 ) =578-581)不僅增加了分離的困難， 而且所得到的同功酶往往并非是所希望的目標蛋白。芥藍是我國南方特有的蔬菜品種之一，因其質脆、清鮮、營養豐富深受廣大消費者喜愛，并且遠銷東南亞等國家和地區。但是對芥藍過氧化物酶的研究有限，尚未有芥藍過氧化物酶分離純化方法的報道。因此，開發芥藍過氧化物酶的純化方法，簡化現有植物過氧化物酶的純化步驟，從并存的多個過氧化物酶同功酶中分離出特定的種類，具有一定的價值。
發明內容
本發明的目的在于提供一種芥藍過氧化物酶的純化方法，簡化步驟，提高同功酶分離的針對性。實現上述目的的技術方案如下(1)硫酸銨沉淀芥藍蛋白粗提液，在4°C下邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨，當硫酸銨質量體積比濃度達到31%時，10000-12000rpm離心，棄去沉淀；繼續添加硫酸銨，至質量體積比濃度為62% ； 隨后10000-12000rpm離心沉淀，棄去上清液，向每Ig沉淀中加入磷酸緩沖液QOmmol/L， pH7. 5) 10-15mL,于4°C下緩慢攪拌lh，隨后10000-12000rpm離心，棄去沉淀，上清液即為酶液I。(2)疏水層析
將步驟(1)得到的酶液I上樣于Phenyl Sefinose 6Fast Flow，然后用含有質量體積比濃度為26-0%硫酸銨的磷酸緩沖液(20mmol/L，pH7. 5)梯度洗脫，收集具有過氧化物酶活性的組分，即為酶液II。(3)離子交換色譜將步驟(2)得到的酶液II上樣于DEAE Sefinose Fast Flow或Mono Q離子交換層析柱，然后用含有質量體積比濃度為0-12% NaCl的磷酸緩沖液(20mmol/L，pH7. 5)梯度洗脫，收集具有過氧化物酶活性的組分，加入超濾濃縮離心管中，3000rpm，4°C離心，得到的濃縮液即為酶液III。(4)凝膠電泳將步驟(3)中得到的酶液III與上樣緩沖液(20mmol/L、pH6. 8的Tris-HCl ；質量體積比濃度為10%的甘氨酸；質量體積比濃度為0. 1-1%的十二烷基磺酸鈉)混合加樣于丙烯酰胺質量濃度為5-6%的濃縮膠及丙烯酰胺質量濃度為10-12%的分離膠上，電泳。電泳后取一條泳道的凝膠用聯苯胺染色，割取對應呈色條帶位置處的其余凝膠，放入去離子水中浸泡12h，上清液凍干即為純化的過氧化物同功酶。上述酶的純度可采用質量濃度為12%的丙烯酰胺，質量體積比濃度為的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為25mmol/L Tris-甘氨酸(pH8. 3)，以考馬斯亮藍R-250染色，甲醇/冰醋酸/蒸餾水(1 1 8)脫色。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果(1)本發明依次采用硫酸銨沉淀、疏水層析、離子交換色譜、凝膠電泳方法純化芥藍過氧化物同功酶，純化步驟少。(2)采用凝膠電泳方法可以純化特定的過氧化物同功酶， 針對性強。將本發明純化的酶液按所述檢測方法檢測，結果為單一條帶，表明產物純度高。
具體實施例方式實施例1利用本發明的方法純化芥藍過氧化物酶，具體為(1)硫酸銨沉淀芥藍蛋白粗提液，在4°C下邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨，當硫酸銨質量體積比濃度達到31 %時，IOOOOrpm離心，棄去沉淀；繼續添加硫酸銨，至質量體積比濃度為62% ；隨后 IOOOOrpm離心沉淀，棄去上清液，向每Ig沉淀中加入磷酸緩沖液(20mmol/L，pH7. 5) 12mL， 于4°C下緩慢攪拌lh，隨后IOOOOrpm離心，棄去沉淀，上清液即為酶液I。(2)疏水層析將步驟(1)得到的酶液I上樣于Phenyl Sefinose 6Fast Flow，然后用含有質量體積比濃度為26-0%硫酸銨的磷酸緩沖液(20mmol/L，pH7. 5)梯度洗脫，收集具有過氧化物酶活性的組分，即為酶液II。(3)離子交換層析將步驟⑵得到的酶液II上樣于DEAE Sefinose Fast Flow離子交換層析柱，然后用含有質量體積比濃度為0-12% NaCl的磷酸緩沖液(20mmol/L，pH7. 5)梯度洗脫，收集具有過氧化物酶活性的組分，加入超濾濃縮離心管中，3000rpm，4°C離心，得到的濃縮液即為酶液II。
(4)凝膠電泳將步驟(3)中的酶液II與上樣緩沖液(20mmol/L、pH6. 8的1Tris-HCl ；質量體積比濃度為10%的甘氨酸；質量體積比濃度為0. 5%的十二烷基磺酸鈉)混合加樣于丙烯酰胺質量濃度為5%的濃縮膠和丙烯酰胺質量濃度為12%的分離膠上，電泳。電泳后取一條泳道的凝膠用聯苯胺染色，割取對應呈色條帶位置處的其余凝膠，放入去離子水中浸泡12h， 上清液凍干即為純化的過氧化物同功酶。純化的過氧化物酶經質量濃度為12%的丙烯酰胺，質量體積比濃度為的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一蛋白條帶。實施例2與實施例1基本相同，其不同之處在于步驟(3)中使用的為Mono Q離子交換層析柱，用含有質量體積比濃度為0_8. 8% NaCl的磷酸緩沖液OOmmol/L，pH7. 5)洗脫。實施例3與實施例2基本相同，其不同之處在于步驟(4)上樣緩沖液中十二烷基磺酸鈉的質量體積比濃度為0. 1% ；濃縮膠的丙烯酰胺質量濃度為6 %，分離膠的丙烯酰胺質量濃度為10%。
權利要求
1.一種芥藍過氧化物酶的純化方法，其特征在于，依次采用硫酸銨沉淀、疏水層析、離子交換色譜和凝膠電泳方法，純化芥藍蛋白粗提液中的過氧化物酶。
2.一種如權利要求1所述的硫酸銨沉淀方法，其特征在于，硫酸銨在芥藍蛋白粗提液中的質量體積比濃度為31-62%。
3.根據權利要求1所述的疏水層析方法，其特征在于，所述層析介質優選Phenyl Sefinose 6Fast Flow0
4.根據權利要求1所述的離子交換色譜方法，其特征在于，所述離子交換介質分別優選DEAE Sefinose Fast Flow、Mono Q0
5.一種如權利要求1所述的凝膠電泳方法，其特征在于，濃縮膠中丙烯酰胺的質量濃度為5-6%，分離膠中丙烯酰胺的質量濃度為10-12%。
全文摘要
本發明屬于植物生物技術領域，公開了一種芥藍過氧化物同功酶的純化方法。本發明以芥藍蛋白粗提液為材料，依次采用硫酸銨沉淀、疏水層析、離子交換色譜和凝膠電泳方法，純化芥藍過氧化物酶。利用本發明的純化方法，步驟簡單、操作方便，針對性強，克服了現有其他植物過氧化物酶純化方法不易分離特定的同功酶的缺陷。
文檔編號C12N9/08GK102304499SQ20111030692
公開日2012年1月4日 申請日期2011年10月12日 優先權日2011年10月12日
發明者唐蕾, 張宏建, 張建華, 毛忠貴, 王趁趁 申請人:江南大學