專利名稱：一種高效表達β-甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌及其酶產品和生產方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵技術和酶工程技術，更確切說是一種高效表達β -甘露聚糖酶的芽孢桿菌及其酶產品和生產方法。
背景技術：
β -甘露聚糖酶是一類能夠水解含有β -葡萄糖苷鍵和β -甘露糖苷鍵的甘露聚糖的內切水解酶，甘露聚糖主要存在于魔芋膠、瓜爾豆膠、槐豆膠、田菁膠中，主要成分是葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等，它們構成了植物半纖維素的第二大組分，水解這些植物中甘露聚糖的酶產品就是β-甘露聚糖酶。
自上世紀80年代Akio. T等美國科學家首次發表甘露聚糖酶的研究 ^ 5fe(Akino Τ, Nakmura N, Horkoshi K. et al. Characterization of three
β -mannanase of an alkalophilic Bacillus sp. [J].Agric Biol Chem. 1988. 52773-779)，甘露聚糖酶及其酶法制取低聚糖的研究就引起人們極大的關注。最近的報道是，李劍芳等(β-甘露聚糖酶高產菌株選育及產酶條件的研究，食品與發酵工業，第 31卷第9期.2005)，張敏等(野皂莢多糖膠制備半乳甘露低聚糖的研究，食品工業斜技， Yol. 29, No. 09，2008)，王玲玲等(酶解法制備低相對分子質量胡蘆巴半乳甘露聚糖及其產物的表征，林產化學與工業，第四卷第2期，Apr. 2009)，吳長菲等(魔芋葡甘露低聚糖的酶法制備工藝的初步研究，生物技術通報2010年卷01期)。還有相關專利文獻CN 1766098 A, 2006. 5. 3; CN 1739949 A, 2006. 6. 28; CN 100516196 C，2007. 7. 22。在上述的一些研究中，或是存在酶活力不高，底物濃度低，成本高，缺乏工業生產的基礎(對半乳甘露聚糖而言尤其如此)；或是水解過程中加堿、加酸，給后處理工藝帶來困難，還不利于環保。因此，水解魔芋膠和瓜爾豆膠中甘露聚糖的β -甘露聚糖酶的制取方法仍然面臨很多技術難題。而這也是本發明創新技術的起點。
發明內容
本發明的目的是利用TQK菌株，通過UV (紫外線誘變)、NTG (亞硝基肌誘變)、微波誘變3種方法重復使用2次的復合誘變，誘導培養能高效表達β -甘露聚糖酶的芽孢桿菌TQBm菌株，及其發酵生產高效能甘露聚糖酶產品的生產方法，從而能高效經濟地轉化生產甘露低聚糖。使用的微生物本發明涉及的芽孢桿菌TQBm，它具有高效表達半纖維素酶的特性該菌株于2011年8月14日在中國典型培養物保藏中心保藏，地址.中國.武漢.武漢大學，保藏號為 CCTCC No :M 211147 (Bacillus subtilis TQBm)。芽孢桿菌TQBm菌株的菌學特性
a、形態特征單個細胞0.7 0. 8X2 3微米、著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0. 6 0. 9X1. 0 1. 5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。b、生理生化特征菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色、在液體培養基中生長時，形成皺醚；需氧菌；可利用蛋白質、多種糖及淀粉。在半纖維素的誘導下產生半纖維素酶，在低聚甘露糖的生產上起到關鍵作用。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖。本發明是這樣實現的。從中國典型培養物保藏中心取得的TQK菌株(保藏號為 CCTCC No =M 207129)為出發菌，先采用UV (紫外線誘變)，條件是紫外燈功率15 30w， 照射距離20 50cm，照射時間1 Smin ；再采用NTG (亞硝基胍誘變)，條件是NTG濃度 1 ;3mg/ml，在pH6.0的tris緩沖液中，處理90 120min ；最后采用微波誘變，條件是家用微波爐，2450MHz，最小功率80w，最大功率800w，培養皿不加蓋、快速冰上冷卻，最佳處理時間為50s。按上述3種復合誘變方法及順序重復使用2次后，將菌種接種在含有0. 1 0. 5%的剛果紅平板培養基中，30 35°C，誘導培養M 48小時，可見透明水解圈。培養基配方按質量百分比計為瓊脂1. 5 2. 5%，魔芋膠酶解物 < 糖度10Βχ>1. 5 5. 0%，(或者瓜爾豆膠酶解物 < 糖度10Βχ>1. 5 5. 0%，)以此對菌種進行適應性馴化和有效誘導，胰蛋白胨0. 5 2 %，酵母浸粉0. 5 2%，NaCl 0. 1 0. 5%,剛果紅0. 1 0. 5%。選取水解圈直徑H/C菌落直徑比值大的菌株，進行搖瓶復篩，通過DNS法測定酶活。平均酶活力培養基配方中碳源用魔芋膠酶解物的達到1600 μ/ml，培養基配方中碳源用瓜爾豆膠酶解物的達到950 μ /ml。選取優良菌株進行穩定傳代3代，最后得到高產半纖維素酶斜面菌株。將該菌株命名為TQBm，于4°C冰箱中保存。并送中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No M 211147 (簡稱 TQBm)。發酵產酶工藝包括如下步驟
1、一級液體培養即從斜面到500ml三角瓶的放大培養，接種量為TQBm斜面菌一環， 在30 ;35°C，200 300r/min, pH6. 5 7. 5條件下，在液體培養基中培養12 M小時。培養基配方按質量百分比計魔芋膠酶解物 < 糖度10Bx>2. 5 5. 0%，(或者瓜爾豆膠酶解物 < 糖度10Βχ>1· 5 5. 0%)，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉0. 5 2%，Na2HPO4 12Η20 1 3%, KH2PO4 0. 1 0. 5%, NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5，豆粕粉 1 5%,玉米渣 1 5%，其余為水，加水至500ml。2、7L小罐發酵產酶(專用于酶解魔芋膠)
以2 5%的接種量接種，培養條件35 37 "C, 300 500r/min, pH6. 5 7. 5，培養 18 M小時，培養基配方為魔芋膠酶解物 < 糖度10Bx>5 15%，無機鹽復合成份1. 5 3. 5 %，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉0. 5 2%，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5%。發酵旺盛時補加純氧，組成富氧空氣，保證發酵液溶氧濃度為30% 80% ；培養結束后，DNS法測定酶液的活力，平均酶活力達到2000 μ /ml。所述無機鹽復合成份為Na2HPO4 12H20 1 3%、KH2PO4 0. 1 0. 5%、NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5 ；
最佳配方魔芋膠酶解物 < 糖度10Bx>10. 0%，無機鹽復合成份2. 5%，酶母浸粉1. 0%， 胰蛋白胨1.0%，玉米渣3%;最佳培養條件35士1°0，400171^11，？!17.0;最佳培養22小時； 通入壓縮空氣，發酵旺盛時補加純氧，組成富氧空氣，保證發酵液溶氧濃度為65%。
3、7L小罐發酵產酶(專用于酶解瓜爾豆膠)
除培養基配方中的碳源為瓜爾豆膠酶解物 < 糖度10Bx>5 15%外，其它條件與第2步相同，培養結束后，DNS法測定酶液的活力，平均酶活力達到1350μ/πι1。4、酶的純化
發酵完成后，用大容量低溫高速離心機以6000r/min將發酵液中培養基殘余物及部分菌體除去。用0. 1 μ m的微濾膜對粗濾液進行純化處理，進一步除去殘存的微量菌體，再用 6000D超濾膜進行處理，濃縮除去部分水和無機鹽類物質，酶收得率> 85%。5、β —甘露聚糖酶于低溫0 4°C下貯存。本發明與現有技術相比具有以下突出特點 1、三重復合誘變技術構建出高效產酶菌株
本發明采用UV+ NTG+微波誘變的復合誘變技術，并按相同順序重復誘變2次，其復合誘變的協同效應大大增強，比通常的2種復合誘變技術的效果提高了 33%。篩選出新型的 TQBm菌株，可高效表達β -甘露聚糖酶，方法簡便，效率高。2、新碳源用作產酶誘導物提高了酶作用效率
本發明在發酵過程中的碳源分別采用魔芋膠和瓜爾豆膠的酶解物(糖度ΙΟΒχ，粘度 260 觀0 mPa. s，估算分子量為8，000 20，000)代替高分子魔芋膠和瓜爾豆膠分別進行誘導產酶，降低了培養基的粘度，使菌種能夠更充分吸收碳營養素。尤其重要的是，用較小分子的碳營養素作有效誘導，酶分子的結構也發生了有益變化，大大提高酶作用的效率，特別是提高了底物濃度酶作用于魔芋膠時，底物濃度可達到創記錄的15 20%，Iml酶液轉化30g魔芋膠，可降低能耗10 15% ；而酶作用于瓜爾豆膠時，底物濃度可達到10 15%， Iml酶液轉化15g瓜爾豆膠，可降低能耗15 20%，從而在全球范圍內首次使酶解瓜爾豆膠的工業規模生產成為可能，遠遠高于目前的研究水平。3、發酵產出的酶液收得率高
由于培養基中的碳營養素是用相對小分子的糖物質，菌種發酵產酶率提高了 8 10%， 再經精細化的酶液純化操作，酶收得率可達到85%，技術經濟效果顯著。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發明做進一步地詳細說明。實施例1 高效表達β -甘露聚糖酶的TQBm菌株選育。從中國典型培養物保藏中心保藏取得的TQK菌株(保藏號為CCTCC No =M 2071 )為出發菌，先采用UV (紫外線誘變)，條件是紫外燈功率15 30w，照射距離20 50cm，照射時間1 8min;再采用NTG (亞硝基胍誘變)，條件是NTG濃度1 ;3mg/ml， 在pH6. 0的tris緩沖液中，處理90 120min ；最后采用微波誘變，條件是家用微波爐， M50MHz，最小功率80w，最大功率800w，培養皿不加蓋、快速冰上冷卻，最佳處理時間為 50s。按上述3種復合誘變方法及順序重復使用2次后，將菌種接種在含有0. 1 0. 5%的剛果紅平板培養基中，30 35°C，誘導培養M 48小時，可見透明水解圈。培養基配方按質量百分比計為瓊脂1. 5 2. 5%，魔芋膠酶解物〈糖度10Βχ>1. 5 5. 0%，瓜爾豆膠酶解物 < 糖度10Βχ>1. 5 5. 0%，以此對菌種進行適應性馴化和有效誘導)，胰蛋白胨0. 5 2 %，酵母浸粉0. 5 2%, NaCl 0. 1 0. 5%,剛果紅0. 1 0. 5%。選取水解圈直徑H/C菌落直徑比值大的菌株，進行搖瓶復篩，通過DNS法測定酶活。平均酶活力培養基配方中碳源用魔芋膠酶解物的達到1600 μ/ml，培養基配方中碳源用瓜爾豆膠酶解物的達到950 μ /ml。實施例2:發酵生產β -甘露聚糖酶——用于酶解魔芋膠
(1)將TQfei菌株(保藏號為CCTCC No: Μ2011147)用劃線接種在含酵母浸粉1. 5%，胰蛋白胨1. 5%，氯化鈉0. 5 %，魔芋膠酶解物(糖度IOBx) 5. 0%，瓊脂2. 0%的平面培養基上， 33°C溫度下培養M小時后使用。(2)—級液體培養用500ml的三角瓶裝150ml含酵母浸粉1. 5%，胰蛋白胨 1. 5%,氯化鈉0. 5%，魔芋膠酶解物(糖度10Bx)10. 0%的液體培養基，10磅滅菌20分鐘，接種一環，34°C搖床上震蕩Q60r/min)培養M小時。(3)用7升發酵罐裝5升含酵母浸粉，胰蛋白陳，魔芋膠酶解物(糖度ΙΟΒχ)，無機鹽復合成份，豆粕粉、玉米渣組成的液體培養基，同上滅菌后接搖瓶種子150ml于35°C 下通氣攪拌18 M小時出罐放料。(4)低溫離心分離酶液用大容量低溫高速離心機以6000r/min的轉速在4 V 條件下離心15 20分鐘，除去菌體等殘存物，取出上清液得本發明所說的酶液，置0 4°C低溫保存備用。此酶液專用于酶解魔芋膠，稱為酶解魔芋膠專用酶液BM— I。(5) DNS 法檢測發酵液酶活力。在 30 ;35°C，200 300r/min，ρΡΗ6· 5 7. 5條件下，酶活可達2000 μ/ml。實施例3:發酵生產β -甘露聚糖酶——用于酶解瓜爾豆膠
(1)將TQfei菌株(保藏號為CCTCC No: Μ2011147)用劃線接種在含酵母浸粉1. 0%，胰蛋白胨1. 0%，氯化鈉0. 5 %，瓜爾豆膠酶解物(糖度10Βχ)5. 0%，瓊脂2. 0%的平面培養基上， 33°C溫度下培養M小時后使用。(2)—級液體培養用500ml的三角瓶裝150ml含酵母浸粉1. 5%，胰蛋白胨 1. 5%,氯化鈉0. 5%，瓜爾豆膠酶解物(糖度10Bx)10. 0%的液體培養基，10磅滅菌20分鐘， 接種一環，34°C搖床上震蕩Q60r/min)培養M小時。(3)用7升發酵罐裝5升含酵母浸粉，胰蛋白陳，半纖維素之瓜爾豆膠，無機鹽復合成份，豆粕粉、玉米渣組成的液體培養基，同上滅菌后接搖瓶種子150ml于35°C下通氣攪拌18 M小時出罐放料。(4)低溫離心分離酶液用大容量低溫高速離心機以6000r/min的轉速在4 V 條件下離心15 20分鐘，除去菌體等殘存物，取出上清液得本發明所說的酶液，置0 4°C低溫保存備用。(5) DNS 法檢測發酵液酶活力。在 30 !35°C，200 300r/min，ρΡΗ6· 5 7. 5條件下，酶活可達1350μ/ml，此酶液專用于酶解瓜爾豆膠，稱為酶解瓜爾豆膠專用酶液 BM—II。此種BM— II酶液還可以高效酶解槐豆膠，田菁膠。酶活的測定，采用DNS法測定酶液的活力。1、DNS法測酶活以0. 5%魔芋膠或瓜爾豆膠為底物，50°C水浴保溫反應lOmin， 加入DNS試劑，沸水浴中顯色lOmin，用純水稀釋定容到25ml。用721分光光度計，在520 nm處進行比色。通過測定OD值求出對應的還原糖含量，再用酶活公式計算求出酶活力。酶活力定義為在50°C、pH6.0條樣下，每分鐘生成Iymol相當于D—甘露糖(D—marmose)的還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。2、酶活計算公式為
公式 X = AX lml/VX FX 1 / TX 1000 / 180 式中X 酶活力，ymol /1111^:0—甘露糖生成量，1^。3、降解測粘法酶生產過程中，檢驗酶液質量的另一方法是1ml酶液，于50°C， pH7. 0左右，將10 20g半纖維素(底物濃度10 20%)降解成低聚甘露糖所需時間為2 4小時，降解液粘度為60 120mPa. s。該方法和生產實踐聯系密切。
權利要求
1.一種高效表達β-甘露聚糖酶的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtill ) TQBm，其保藏號為 CCTCC No: M 211147。
2.—種甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于是使用權利要求1所述的枯草芽孢桿菌TQfei按下述步驟發酵生產的a、一級液體培養即從斜面到500ml三角瓶的放大培養，接種量為TQBm斜面菌一環， 在30 ;35°C，200 300r/min, pH6. 5 7. 5條件下，在液體培養基中培養12 M小時，培養基配方按質量百分比計魔芋膠酶解物 < 糖度10Bx>2. 5 5. 0%，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉 0. 5 2%，Na2HPO4 12H20 1 3%，KH2PO4 0. 1 0. 5%, NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5%，其余為水，加水至500ml ；b、7L小罐發酵產酶以2 5%的接種量接種，培養條件35 37°C, 300 500r/ min, pH6. 5 7. 5，培養18 M小時，培養基配方為魔芋膠酶解物 < 糖度10Bx>5 15%， 無機鹽復合成份1. 5 3. 5 %，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉0. 5 2%，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5% ；發酵旺盛時補加純氧，組成富氧空氣，保證發酵液溶氧濃度為30% 80% ；所述無機鹽復合成份為 Na2HPO4 12H20 1 3%、KH2PO4 0. 1 0. 5%、NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5 ；C、酶的純化發酵完成后，用大容量低溫高速離心機以6000r/min將發酵液中培養基殘余物及部分菌體除去，用0. 1 μ m的微濾膜對粗濾液進行純化處理，進一步除去殘存的微量菌體，再用 6000D超濾膜進行處理，濃縮除去部分水和無機鹽類物質，酶收得率> 85% ；d、β -甘露聚糖酶于低溫0 4°C下貯存；此酶液稱為酶解魔芋膠專用酶液BM— I。
3.根據權利要求2所述的一種甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于在b)步驟中，最佳配方魔芋膠酶解物 < 糖度10Bx>10. 0%，無機鹽復合成份2. 5%，酶母浸粉1. 0%， 胰蛋白胨1.0%，玉米渣3%;最佳培養條件35士1°0，400171^11，？!17.0;最佳培養22小時； 通入壓縮空氣，發酵旺盛時補加純氧，組成富氧空氣，保證發酵液溶氧濃度為65% ；所述無機鹽復合成份為 Na2HPO4 12H20 1 3%、KH2PO4 0. 1 0. 5%、NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5。
4.一種甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于是使用權利要求1所述的枯草芽孢桿菌TQfei按下述步驟發酵生產的a、一級液體培養即從斜面到500ml三角瓶的放大培養，接種量為TQBm斜面菌一環， 在30 ;35°C，200 300r/min, pH6. 5 7. 5條件下，在液體培養基中培養12 M小時，培養基配方按質量百分比計瓜爾豆膠酶解物 < 糖度10Bx>2. 5 5. 0%，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉 0. 5 2%，Na2HPO4 12H20 1 3%，KH2PO4 0. 1 0. 5%, NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5%，其余為水，加水至500ml ；b、7L小罐發酵產酶以2 5%的接種量接種，培養條件35 37°C, 300 500r/ min,pH6. 5 7. 5，培養18 M小時，培養基配方為瓜爾豆膠酶解物 < 糖度10Bx>5 15%， 無機鹽復合成份2. 5 3. 5 %，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉0. 5 2%，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5%，通入壓縮空氣，發酵旺盛時補加純氧，組成富氧空氣，保證發酵液溶氧濃度為 30% 80% ；C、酶的純化發酵完成后，用大容量低溫高速離心機以6000r/min將發酵液中培養基殘余物及部分菌體除去，用0. 1 μ m的微濾膜對粗濾液進行純化處理，進一步除去殘存的微量菌體，再用 6000D超濾膜進行處理，濃縮除去部分水和無機鹽類物質，酶收得率> 85% ；d、β -甘露聚糖酶于低溫0 4°C下貯存；此酶液稱為酶解瓜爾豆膠專用酶液BM—II。
5.根據權利要求4所述的一種β-甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于在b)步驟中，最佳配方瓜爾豆膠酶解物 < 糖度10Bx>10. 0%，無機鹽復合成份2. 5%，酶母浸粉 1. 0%，胰蛋白胨1. 0%，玉米渣3% ；最佳培養條件35 士 rC,400r/min,pH7. 0 ；最佳培養22 小時；通入壓縮空氣，發酵旺盛時補加純氧，組成富氧空氣，保證發酵液溶氧濃度為65% ；所述無機鹽復合成份為 Na2HPO4 12H20 1 3%、KH2PO4 0. 1 0. 5%、NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5。
全文摘要
本發明提出了一種以枯草芽孢桿菌TQK為出發菌，采用UV+NTG+微波誘變3種方法重復使用2次的復合誘變技術，誘導培養能高效表達β-甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌TQBm菌株，其保藏號為CCTCCNo:M211147，用該TQBm菌株發酵生產高效能β-甘露聚糖酶及酶產品BM--Ⅰ、BM--Ⅱ。在優化產酶條件下可發酵得到平均酶活力為1000～2000μ/ml的高效能β-甘露聚糖酶，1ml酶液可轉化10～20g甘露聚糖，底物濃度可達到10～20%。通過本發明培養出的TQBm菌株產酶量大，酶活力高，使用該酶產品能高效經濟地水解魔芋、瓜爾豆、槐豆、田菁等植物中的甘露聚糖，生產甘露低聚糖。
文檔編號C12N1/20GK102373168SQ20111030471
公開日2012年3月14日 申請日期2011年10月10日 優先權日2011年10月10日
發明者萬霞, 彭冬秋, 汪修武, 錢乾, 錢金宏, 黃云琦, 黃代勇, 黃芳 申請人:武漢東方天琪生物工程有限公司