專利名稱：一種人臍帶間充質細胞的分離和培養方法
技術領域：
本發明涉及一種人臍帶間充質細胞的分離和培養方法。
背景技術：
因胚胎干細胞受倫理學限制，2006年日本學者Siinya Yamanaka將鼠成纖維細胞重編程為多潛能分化干細胞，該細胞理論上具有分化為三胚層細胞能力。2007年日本學者 Shinya Yamanaka與美國學者Thompson將人皮膚成纖維細胞重編程為多潛能分化干細胞， 隨后全球掀起多潛能分化干細胞重編程熱潮，但是目前重編程細胞來源受個體差異、免疫反應、動物源性成分污染等困擾，因此，需要尋找一種容易獲得，不存在倫理學限制、免疫反應和動物源性污染等問題的重編程細胞來源，以保證多潛能分化干細胞能安全、普遍地應用于臨床。
發明內容
本發明的目的在于提供一種人臍帶間充質細胞的分離和培養方法，其具有操作簡單、易于推廣等優點，能夠方便地獲取低免疫源性的人臍帶間充質細胞，其作為重編程細胞來源，可重編程為多潛能分化干細胞，供基礎與臨床研究用。本發明的目的是通過以下技術方案實現的一種人臍帶間充質細胞的分離方法， 包括以下步驟1)取人臍帶活組織，洗凈，切碎；2)加入膠原酶IV，置于(X)2培養箱中進行消化處理，然后加入DMEM/F12培養基終止消化，離心，棄上清液；3)加入胰酶，置于(X)2培養箱中進行消化處理，然后加入DMEM/F12培養基終止消化；4)過濾，取濾液進行離心，離心后棄上清液，然后加入DMEM/F12培養基重懸細胞。進一步地，在所述的步驟2)中，膠原酶IV的濃度為lmg/ml ;3mg/ml，消化處理的時間為3. 5 4. 5小時。膠原酶IV能夠從組織中消化下細胞，具有作用溫和、對細胞損傷較小等優點，實驗表明，采用濃度為lmg/ml 3mg/ml的膠原酶IV消化3. 5 4. 5小時，得到的單個細胞量最多，而且細胞活力最佳；如果降低膠原酶IV的濃度、延長消化處理的時間，或者提高膠原酶IV的濃度、縮短消化處理的時間，均不利于單個細胞數量和細胞活力的最大化。進一步地，在所述的步驟3)中，胰酶的濃度為0. 05% 0. 50%，消化處理的時間為10 20分鐘。進一步地，所述的胰酶中還添加有濃度為0. 02%的EDTA。經膠原酶IV分離得到的細胞往往是抱團生長的，并非單細胞生長。而胰酶是多種酶的復合體，它能夠將組織分化為單個細胞，以供單個細胞貼壁生長。在胰酶中添加EDTA 是為了螯合鈣鎂離子(因為鈣鎂離子會抑制胰酶的活性以及破壞細胞間的連結結構)，進一步提高胰酶的活性，使細胞能夠分散成單個細胞，從而獲得數量和活力最大化的單個貼壁生長的臍帶間充質細胞。進一步地，所述的DMEM/F12培養基中還添加有10% FBS、1 %非必需氨基酸、1 % L-谷氨酸鹽、青-鏈霉素和ImM 2-巰基乙醇。進一步地，所述步驟2)和步驟4)中的離心條件為1500rpm 3000rpm，5 10分鐘。采用這一離心條件，能夠最大限度地減少原代細胞在離心過程中死亡。進一步地，在所述的步驟2)和步驟3)中，CO2培養箱的培養條件為37°C、5% CO20進一步地，在所述的步驟4)中，采用直徑為40 μ m的呢絨濾網進行過濾。呢絨濾網具有滑糯、柔軟、懸垂性好、對細胞損傷小等優點，而40 μ m的濾孔直徑與臍帶間充質細胞的直徑相當，能夠只讓單個臍帶間充質細胞通過，其它未被消化為單個細胞的則不能通過，從而提高了細胞的純度。一種人臍帶間充質細胞的培養方法，包括以下步驟a.采用明膠對培養皿進行包被處理，然后用無Ca2+和Mg2+的PBS緩沖液對該培養皿進行洗滌；b.取根據本發明所述分離方法獲得的細胞，接種到經步驟a處理后的培養皿中；c.待細胞匯合生長至85% 90%時，進行消化傳代。進一步地，在所述的步驟a中，采用濃度為0. 01% 0. 02%的明膠對培養皿包被 20 30分鐘。進一步地，在所述的步驟b中，細胞以0. 5X IO5 1. OXlO5的濃度接種到經步驟
a處理后的培養皿中。本發明采用酶消化法獲得人臍帶間充質細胞，該方法具有操作簡單、容易掌握、便于推廣等優點，而且獲得的人臍帶間充質細胞免疫源性低，無動物源性細胞污染，不存在傳播異種病原體的危險，為日后人臍帶間充質細胞重編程為多潛能分化干細胞的應用進行鋪墊。
具體實施例方式DMEM/F12培養基的準備在DMEM/F12基礎培養基中添加10% FBS、1%非必需氨基酸、L-谷氨酸鹽、青-鏈霉素和ImM 2-巰基乙醇。取1 3厘米破宮產近胎兒端人臍帶活組織，采用無Ca2+和Mg2+的PBS緩沖液對人臍帶活組織進行清洗，并將人臍帶活組織切碎至0. 5 1毫米的大小。將剪碎的人臍帶組織塊平鋪至IOcm的培養皿中，加入IOml濃度為ang/ml的膠原酶IV，置于37°C、5% CO2培養箱中4小時，然后加入DMEM/F12培養基終止消化，在3000rpm 下離心8分鐘，吸棄上清液。加入8ml濃度為0.25%的胰酶(含0. 02%的EDTA)，置于37°C、5% CO2培養箱中 15分鐘，然后加入DMEM/F12培養基終止消化，并用孔徑為40 μ m的呢絨濾網進行過濾，取濾液在1500rpm下離心8分鐘，吸棄上清液，加入DMEM/F12培養基，重懸細胞。取IOcm的培養皿，預先用濃度為0. 01 %的明膠包被30分鐘，然后用無Ca2+和Mg2+ 的PBS緩沖液洗滌2次。以IXlO5的濃度，將得到的細胞懸液接種在該培養皿中。每周換液2次，直至細胞匯合生長至85%，進行消化傳代。
權利要求
1.一種人臍帶間充質細胞的分離方法，包括以下步驟1)取人臍帶活組織，洗凈，切碎；2)加入膠原酶IV，置于(X)2培養箱中進行消化處理，然后加入DMEM/F12培養基終止消化，離心，棄上清液；3)加入胰酶，置于(X)2培養箱中進行消化處理，然后加入DMEM/F12培養基終止消化；4)過濾，取濾液進行離心，離心后棄上清液，然后加入DMEM/F12培養基重懸細胞。
2.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于在所述的步驟2)中，膠原酶IV的濃度為lmg/ml 3mg/ml，消化處理的時間為3. 5 4. 5小時。
3.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于在所述的步驟幻中，胰酶的濃度為 0. 05% 0. 50%，消化處理的時間為10 20分鐘。
4.根據權利要求3所述的分離方法，其特征在于所述的胰酶中還添加有濃度為 0. 02% 的 EDTA。
5.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于所述的DMEM/F12培養基中還添加有 10% FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酸鹽、青-鏈霉素和ImM 2-巰基乙醇。
6.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于所述的步驟2)、步驟4)中的離心條件為 1500rpm 3000rpm, 5 10 分鐘。
7.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于在所述的步驟2)和步驟3)中，CO2 培養箱的培養條件為37°C、5% C02。
8.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于在所述的步驟4)中，采用直徑為 40 μ m的呢絨濾網進行過濾。
9.一種人臍帶間充質細胞的培養方法，包括以下步驟a.采用明膠對培養皿進行包被處理，然后用無Ca2+和Mg2+的PBS緩沖液對該培養皿進行洗滌；b.取根據權利要求1所述分離方法獲得的細胞，接種到經步驟a處理后的培養皿中；c.待細胞匯合生長至85% 90%時，進行消化傳代。
10.根據權利要求9所述的培養方法，其特征在于在所述的步驟a中，采用濃度為 0. 01% 0. 02%的明膠對培養皿包被20 30分鐘。
11.根據權利要求9所述的培養方法，其特征在于在所述的步驟b中，細胞以 0. 5 X IO5 1. OX IO5的濃度接種到經步驟a處理后的培養皿中。
全文摘要
本發明公開了一種人臍帶間充質細胞的分離和培養方法，該方法采用膠原酶IV和胰酶對人臍帶活組織進行消化處理，并將分離得到的人臍帶間充質細胞接種于預先用明膠包被的培養皿中進行擴增。本發明所述的分離培養方法具有操作簡單、易于推廣等優點，能夠方便地獲取低免疫源性的人臍帶間充質細胞。
文檔編號C12N5/077GK102321575SQ20111030090
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月8日 優先權日2011年10月8日
發明者盧海, 高毅 申請人:南方醫科大學珠江醫院