專利名稱：一種vhl基因突變檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種VHL基因突變檢測特異性引物和液相芯片。
背景技術：
VHL基因得名于Von Hippel-Lindau (VHL)病，含有14543bp，包含3個外顯子和2個內含子。VHL病為臨床十分罕見的家族性常染色體顯性遺傳性腫瘤病，包括中樞神經系統血管母細胞瘤、內臟腫瘤和囊腫等，1993年，Latif等通過連鎖分析將VHL基因定位于染色體3p25-26，并首次成功克隆了 VHL基因。VHL基因為抑癌基因，該基因的失活會導致正常的VHL蛋白合成障礙，與腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, CCRCC)的發生發展有著密切的關系。目前對于VHL基因的結構與功能及其調控途徑的研究取得重要進展，而且已明確VHL基因的失活機制，主要包括基因突變，雜合性缺失和甲基化。本發明主要檢測VHL基因常見的六種基因型T240A、T254C、T266A、C286T、G388C和444delT。目前，對VHL基因突變進行檢測和分析的方法很少，主要有直接測序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突變造成的限制性內切酶識別位點的改變，如位點丟失或產生新位點，通過PCR擴增某一特定片段，再用限制性內切酶酶切擴增產物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒有產生新酶切位點的基因突變檢測。再次，以上這些方法都存在著檢測通量的局限性，每次只能檢測一種突變類型，不能滿足實際應用的需要。
發明內容
本發明的目的之一是提供VHL基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于單獨或并行檢測VHL基因六種常見基因型的T240A、T254C、T266A、C286T、G388C和444delT野生型和突變型。實現上述目的的技術方案如下一種VHL基因突變檢測液相芯片，包括有(A).針對VHL基因不同突變位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對T240A位點的SEQ ID NO. 13以及SEQ ID NO. 14 ;針對T254C位點的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ;針對 T266A 位點的 SEQ ID NO. 17 及 SEQ ID NO. 18 ;針對 C286T 位點的 SEQID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;針對 G388C 位點的 SEQ ID NO. 21 及 SEQID NO. 22 ;和/或針對444delT位點的SEQ ID NO. 23及SEQ ID NO. 24 ;所述tag序列選自SEQ ID NO.1 SEQ IDN0.12 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 25 SEQ ID NO. 36，且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。優選地，所述擴增引物為針對T240A、T254C、T266A、C286T位點的SEQ ID NO. 37及SEQID NO. 38 ;和 / 或針對 G388C、444delT 位點的 SEQ ID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。 優選地，所述ASPE引物為針對T240A位點的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 13組成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 14組成的序列；針對T254C位點的由SEQ IDNO. 3和SEQ IDN0. 15組成的序列以及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 16組成的序列；針對T266A位點的由SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 17組成的序列以及由SEQ ID NO. 6和SEQ IDNO. 18組成的序列；針對C286T位點的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 19組成的序列以及由SEQ ID NO. 8和SEQ IDN0. 20組成的序列；針對G388C位點的由SEQ ID NO. 9和SEQ IDNO. 21組成的序列以及由SEQID NO. 10和SEQ ID NO. 22組成的序列；和/或針對444delT位點的由SEQ ID NO. 11和SEQ IDN0. 23組成的序列以及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 24組成的序列。本發明的另ー目的是提供用于VHL基因突變檢測的特異性引物。實現上述目的的技術方案如下用于VHL基因突變檢測的特異性引物，其為針對T240A位點的SEQ ID NO. 13以及 SEQID NO. 14 ;針對 T254C 位點的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ;針對 T266A 位點的 SEQID NO. 17 及 SEQ ID NO. 18 ;針對 C286T 位點的 SEQ ID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;針對 G388C位點的 SEQID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;和/或針對 444delT 位點的 SEQ ID NO. 23 及 SEQID NO. 24。本發明的主要優點在干1.本發明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達100%。且檢測所需要的時間遠遠低于常用的測序技術，特別符合實際應用需要。所制備的VHL基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag標簽序列、ant1-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與具體ASPE引物的結合，能夠避免交叉反應，實現多個突變位點的并行檢測。2.本發明通過發明人長期積累的設計經驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優的組合。本發明設計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標檢測的突變位點，準確區分各種型別的基因型；在同一個反應體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標檢測的PCR擴增產物之間基本上不存在交叉反應，檢測特異性好，交叉反應率低于3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點的突變情況，檢測效果一致。3.本發明的檢測方法步驟簡単，6種突變位點檢測可通過ー步PCR即可完成2條含有突變位點的目標序列的擴增，避免了反復多次PCR等復雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發明不僅克服了傳統固相芯片敏感性不高，檢測結果的可重復性差的缺陷，同時對現有的液相芯片技術進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進ー步得到提高，信噪比增強，檢測結果更加準確可靠。
具體實施例方式實施例1VHL基因突變檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對VHL 基因六種常見基因型 T240A、T254C、T266A、C286T、G388C 和 444delT 的野生型和突變型，分別設計特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表IVHL基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
權利要求
1.一種VHL基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有 (A).針對VHL基因不同突變位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對T240A位點的SEQ ID NO. 13以及SEQ ID NO. 14 ;針對T254C位點的SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ;針對 T266A 位點的 SEQ ID NO. 17 及 SEQ ID NO. 18 ;針對C286T 位點的 SEQID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;針對 G388C 位點的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ IDNO. 22 ;和/或針對444delT位點的SEQ ID NO. 23及SEQ ID NO. 24 ;所述tag序列選自SEQID NO.1 SEQ IDNO. 12 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 25 SEQ ID NO. 36，且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).用于擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。
2.根據權利要求1所述的VHL基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為針對 T240A、T254C、T266A、C286T 位點的 SEQ ID NO. 37 及 SEQ ID NO. 38 ;和 / 或針對 G388C、444delT 位點的 SEQ ID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。
3.根據權利要求1所述的VHL基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物為針對T240A位點的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 13組成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQIDNO. 14組成的序列；針對T254C位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 15組成的序列以及由SEQID NO. 4和SEQ ID NO. 16組成的序列；針對T266A位點的由SEQ ID NO. 5和SEQ IDNO. 17組成的序列以及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 18組成的序列；針對C286T位點的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 19組成的序列以及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 20組成的序列；針對G388C位點的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 21組成的序列以及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 22組成的序列；和/或針對444delT位點的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 23組成的序列以及由SEQ IDNO. 12和SEQ ID NO. 24組成的序列。
4.根據權利要求1所述的VHL基因突變檢測液相芯片，其特征是， (A)所述ASPE弓丨物為針對T240A位點的由SEQID NO.1和SEQ ID NO. 13組成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 14組成的序列；針對T254C位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 15組成的序列以及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 16組成的序列；針對T266A位點的由SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 17組成的序列以及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 18組成的序列；針對C286T位點的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 19組成的序列以及由SEQ IDNO. 8和SEQ IDNO. 20組成的序列；針對G388C位點的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 21組成的序列以及由SEQID NO. 10和SEQ ID NO. 22組成的序列；和針對444delT位點的由SEQID NO. 11和SEQ IDNO. 23組成的序列以及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 24組成的序列； (B)有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 25 SEQ ID NO. 36，且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C)所述擴增引物為針對T240A、T254C、T266A、C286T 位點的 SEQ ID NO. 37 及 SEQIDNO. 38 ;和針對 G388C、444delT 位點的 SEQ ID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。
5.根據權利要求1-4任一項所述的VHL基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10個T。
6.用于VHL基因突變檢測的特異性引物，其特征是，所述特異性引物序列為針對T240A位點的SEQ ID NO. 13 以及SEQ ID NO. 14 ;針對T254C位點的SEQ ID NO. 15及SEQ IDNO. 16 ;針對T266A位點的SEQ ID NO. 17及SEQ ID NO. 18 ;針對C286T位點的SEQ ID NO. 19及 SEQ IDNO. 20 ;針對 G388C 位點的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;和 / 或針對 444delT位點的 SEQ IDNO. 23 及 SEQ ID NO. 24。
全文摘要
本發明公開了一種VHL基因檢測特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為針對T240A位點的SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.14；針對T254C位點的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；針對T266A位點的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18；針對C286T位點的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20；針對G388C位點的SEQ ID NO.21及SEQID NO.22；和/或針對444delT位點的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24；有anti-tag序列包被的微球；擴增引物。本發明所提供的檢測液相芯片的檢測結果與測序法的吻合率高達100％，實現多個突變位點的野生型和突變型并行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103031367SQ20111030088
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者許嘉森, 吳詩揚 申請人:廣州益善生物技術有限公司