專利名稱：基因工程用工具菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及在分子克隆中可防止重復DNA序列重組的工具菌及其構建和應用。
背景技術：
眾所周知，含有同源序列的兩個DNA序列之間可以發生交換重組，即同源重組。在基因工程領域，業已開發出多種同源重組技術以及許多工程菌用于各種各樣的基因操作。L Red/ET 同源重組Red/ET重組是上個世紀末發明的一種新型的基因工程技術。在Reda/Redi3或 RecE/RecT重組酶系統的相互配合作用下，兩端帶有短同源臂(35 50bp)的供體DNA分子能直接重組到靶標DNA分子上，實現對受體分子的取代、插入、缺失、突變等多種修飾。Red/ ET重組對靶標DNA快速、精確、高效的修飾，同源臂短，不受內切酶位點和DNA片段大小限制的獨特優勢，給基因工程領域帶來了又一場重大變革。該技術已經在大腸桿菌(E. coli)染色體修飾、基因簇的克隆與修飾、質粒的構建、基因打靶載體的構建等領域得到廣泛應用。2.誦i寸Cre-LoxP系統實現的位點特異件重會目來源于Pl噬菌體的Cre重組酶是屬于位點特異性重組酶家族中的重要成員，它是一個大小為38KD的蛋白，能介導兩個LoxP位點(序列)之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組[Hamilton DL 等，JMol Biol. 1984，Vol. 178，No. 2，p. 481-6]。 Cre-LoxP重組系統的一個最大優點是對于有效的重組作用不需要任何補充的輔助因子或者序列元件，以及不依賴細胞外環境。3.大腸桿菌.頂109野牛型(WT)菌株該菌株在使用pUC系列質粒載體進行DNA轉化或用M13噬菌體載體進行轉染時， 由于載體DNA產生的Lac^i多肽和JM09編碼的LacZ Δ Ml5進行α -互補，從而顯示β -半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株。該菌基因型為recAl，endAl，gyrA96，thi-1, hsdR17,supE44,relAl, Δ (la-proAB)/F’ [traD36,proAB, laclq,IacZ ΔM15]。4.大腸桿菌 HS996、HS996~gyrA96 和 BG2005 菌株大腸桿菌HS996 (Gene Bridges GmbH)在以往的BAC修飾和基因克隆中被用作宿主菌來使用。該菌基因型為F-mcrA. (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ801αοΖ.Μ15. lacX74 recAl deoR araD139. (ara-leu) 7697 galU galK rpsL(StrE) endAl nupG fhuA:: IS2 (賦予噬菌體 Tl抗性)。大腸桿菌HS996-gyrA96菌株由于gyrA96基因突變可以產生針對萘啶酸的抗性，所以它是帶有萘啶酸抗性被優化了的基因工程用菌。該菌基因型為F-mCrA. (mrr-hsdRMS-mcrBC)lacX74 recAl gryA deoRaraD139. (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrK) endAl nupG fhuA: : IS2 (賦予噬菌體 Tl 抗性)。大腸桿菌BG2005菌株是來源于經優化的HS996菌株，并且在此菌基礎上通過將 rdd-alpha和recT兩個基因從基因組中缺失，從而被進一步優化了的基因工程用菌。它相對于HS996菌株具有非常明顯提高的DNA穩定性的優勢特性。該菌基因型為F-mCrA. (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ801αοΖ. Μ15. lacX74 recAl deoR araD139. (ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrE) endAlnupG fhuA: : IS2 (賦予噬菌體 Tl 抗性)Δ red-alpha Δ recT。5.大腸桿菌Β.Τ5183和DY380菌株大腸桿菌 BJ5183 (源于 Dr. Douglass Hanahan) (Takahashi N 等，Gene. 2003， Vol. 303，p. 89-97)的基因型為:recBC sbcBC endA galk met thi-1 bioThsdR StrE0在大腸桿菌BJ5183中recE和recT兩個基因被整合到其基因組中并且產生它們的基因產物，recET蛋白對于DNA雙鏈的修復起作用。另外，大腸桿菌BJ5183還攜帶一個編碼內切酶I的endA基因的突變體，這個突變與recBC和sbcA的突變一同賦予對 BJ5183菌株內部的DNA雙鏈較高的修復活性(Kobayashi I等，Adv Biophys. 1992, Vol. 28, ρ· 81-133 ；Takahashi NK 等，J Bacteriol. 1993，Vol. 175，No. 16，p. 5176-85)。大腸桿菌DY380(來自斯坦福大學)是通過缺陷型λ噬菌體整合到大腸桿菌的染色體組中產生的。該菌的重組系統依賴于來自λ噬菌體的Exo、Beta和Gamma重組蛋白， 而不是依賴RecA蛋白。通過該重組系統，人們可以進行質粒、BAC和細菌染色體組的修飾。盡管目前已有各種各樣的用于分子克隆的工程菌，例如以上大腸桿菌菌株，然而對于帶有多個同源序列的某些基因或者大片段的真核生物DNA片段，由于在進行分子克隆時這種基因或DNA片段中的同源序列間自發地發生重組，故用這些工程菌難以實現對這種基因或DNA片段的克隆。因此，需要對這種帶有多個重復的DNA序列的基因、特別是對大片段的真核生物的DNA序列穩定、能夠對這些基因或大片段真換生物DNA序列進行克隆的工程菌。
發明內容
本發明提供一種新的基因工程用工具菌，該工程菌對帶有多個重復的DNA序列的基因、特別是對大片段的真核生物DNA序列穩定，能夠對這些基因或大片段真換生物DNA序列進行克隆。本發明的工程菌優選具有較高的質粒轉化率。具體而言，本發明涉及一種細菌，例如大腸桿菌，其優選來源于大腸桿菌JM109野生型菌株，其中一個或更多個重組酶基因被敲除。在一個實施方案中，在所述細菌中，Red α ,Red^、RecE和RecT重組酶基因中的一個更多個被敲除。在一個優選實施方案中，RecE和RecT重組酶基因中的一個或兩個被敲除。在進一步的實施方案中，RecE和RecT重組酶基因皆被敲除。在一個優選實施方案，fhuA基因被進一步敲除。在上述實施方案中，所述細菌可選地具有鏈霉素抗性。本發明也提供一種多拷貝質粒，其含有一個第一抗性基因、一個第二抗性基因和兩個缺失型第三抗性基因，其中第二抗性基因位于兩個缺失型第三抗性基因之間，這兩個缺失型第三抗性基因所缺失的部分不同，因此可通過同源重組產生完整的第三抗性基因。 所述抗性例如為抗生素抗性。在一個實施方案中，所述第一抗性基因為氨芐青霉素抗性(AmpK)基因，第二抗性基因為卡那霉素抗性(KmK)基因，第三抗性基因為氯霉素抗性(CmK)基因。在一個優選實施方案中，所述質粒為pUC-cm-r印eats質粒。
本發明還提供檢測細菌中DNA穩定性的方法，其包括將上述任一種的多拷貝質粒轉化到所述細菌中，測定所述細菌是否能夠在含有第三抗性所針對的抗生素如氯霉素的培養基中生長。如果細菌能夠在含有該抗生素如氯霉素的培養基中生長，則表明在細菌中DNA 的穩定性較差。
圖1是recET和fhuA基因之菌落PCR產物的限制性內切酶電泳圖譜，其中泳道1，2，7，8 :JM109(WT)；泳道3，5 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA泳道4，6 :JM109-StrE- Δ RecET ；泳道9，11 JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；泳道10，12 :JM109-StrE- Δ RecET ；M為分子量標記。圖加是通過GCK分子克隆軟件顯示recET的菌落PCR產物的限制性內切酶圖譜模型。圖2b是通過GCK分子克隆軟件顯示fhuA的菌落PCR產物的限制性內切酶圖譜模型。圖3 (左圖)經NcoI消化的pUC-cm-r印eats的凝膠圖譜。泳道1 分子量標記； 泳道2-7限制性內切酶NcoI消化后的質粒pUC-cm-r印eats的凝膠電泳圖譜。圖3 (右圖)經NcoI消化的pUC-cm-r印eats的GCK軟件模擬圖譜。圖4顯示pUC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的轉化效率。圖5顯示pBAC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 :JM109-StrK-ARecET。圖6顯示pBAC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的DNA重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。圖7顯示pUC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的DNA重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。圖8顯示pUC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的DNA重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。圖9顯示Red/ET重組條件下pBAC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中期望的DNA
重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。圖10顯示Red/ET重組條件下pBAC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中不期望的
DNA重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。
5
圖Ila和b顯示LAWRIST-mTFIIA粘粒在不同菌株中轉化和檢測結果。其中M表示分子量標記。2#JM109 :2#JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 :4#JM109-StrE-Δ RecET0圖12為LAWRIST7-mTFIIA粘粒的I^stI酶切電泳圖譜，其中泳道1為分子量標記， 泳道2為LAWRIST7-mTFIIA粘粒樣品。
具體實施例方式如上所述，當有待克隆的基因或DNA片段、尤其是大片段的真核生物DNA分子含有多個同源序列時，在分子克隆中其同源序列間會自發地發生重組，導致該基因或DNA片段的分子克隆無法實現。小鼠胚胎肝細胞中的TFIIA基因(粘粒LAWRIST7-mTFIIA，(GeneBridges GmbH)) 的產物是基因特異性轉錄因子IIA，該因子可以促進和調節DNA在體內與TBP(TATA盒結合蛋白)結合，并與啟動子相結合參與轉錄的起始[Liu Q等，Mol Cell Biol. 1999, Vol. 19, No. 12，p. 8673-85]。由于TFIIA基因中包含有許多相當長度和相同序列的DNA同源片段 [Jamsai D等，Genomics. 2003，Vol. 82，No. 1，p. 68-77]，所以在對該基因進行分子克隆時， 其同源序列間自發地發生了重組作用，導致在克隆實驗后，限制性內切酶消化后的電泳圖譜的預期的理想結果與實際酶切結果往往是不一致的，即無法進行分子克隆。經過分析，發現其原因主要為外界環境不穩定，在這些重復序列之間發生了重組或者在不同粘粒中發生了同源序列之間的重組。本發明人利用該TFIIA基因(Cosmids-LAWRIST7-mTFIIA)以及構建的多拷貝檢測質粒pUC-cm-r印eats，用不同的細菌菌株例如大腸桿菌菌株對DNA結構的穩定性進行了研究，意想不到地發現該基因和所述多拷貝檢測質粒在大腸桿菌JM109野生型菌株中比較穩定，未發生重組，而在其它的大腸桿菌菌株中則十分不穩定。實驗方法和結果見實施例3和 5。因此，本發明人選擇大腸桿菌JM109野生型菌株，通過對其進行進一步的修飾，敲除其中的一個或多個重組酶基因，獲得了顯著提高對帶有多個重復DNA序列，特別是對大片段的真核生物的DNA序列的穩定性的工程菌。可以對本發明的工程菌做出進一步的修飾，例如引入抗性基因或敲除其fhuA基因，從而獲得具有額外標記或提高質粒的轉化效率的工程菌。本申請中用于構建新型工程菌的方法也可用于其他細菌、真菌或動物細胞，以構建其他的基因工程用菌或細胞。靶基因的敲除可以采用本領域已知的能夠改變或破壞靶基因或其調控序列的結構、使靶基因功能完全喪失的任何技術，例如同源重組技術來實施。這些技術是本領域已知的。本發明的工程菌可以用于克隆含有多個同源序列的基因或大片段真核生物DNA 分子。由于本發明的工程菌的內部環境缺乏重組酶，因此當利用基因的同源序列進行分子克隆時，可以通過帶有重組酶的質粒進行轉化或共轉化來實施同源重組。本申請中各種操作可以用本領域技術人員已知的方法、例如以下文獻中描述的方法和本申請中所述方法來實施Jos印h Sambrook, et. al.，Molecular Clonning A Laboratory Manual,3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 ；禾口 Carl W. Dieffenbach禾口Gabriela S.Dveksler,PCR primer :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 等。實施例1.使用的材料1.1 細菌所使用的細菌包括大腸桿菌JM109野生型菌株(Gene Bridges GmbH)、 HS996 (Invitrogen) > HS996-gyrA96 (Gene Bridges GmbH) > GB2005 (Gene Bridges GmbH) > BJ5183(Dr. Douglass Hanahan) > DY380 (University of Stenford)胃_。1.2 引物用來進行DNA擴增的引物1#-12#(SEQ ID NO 1-12)都在SIGMA公司定制。2.使用的方法質粒的提取、DNA的分離與純化、限制性內切酶的消化、瓊脂糖凝膠電泳、感受態細胞的制備、質粒的電轉化、菌落PCR反應、PCR擴增反應等操作按照本領域的標準技術，例如 Joseph Sambrook 等，Molecular Clonning :A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 ；禾口 Carl W. Dieffenbach 禾口 Gabriela S.Dveksler, PCR primer :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995等中描述的方法來實施。2. 1細菌培養細菌預培養取2-10ml已經高壓滅菌的LB培養液到15ml試管中，再用消毒過的牙簽挑取單克隆菌株到試管中，在37°C下、1025rpm條件下過夜培養。細菌主培養按照1 50-1 100的比例從預培養的細菌培養液取菌液接種，進行大量培養， 在37°C下、1025rpm搖床條件下培養。2. 2Red/ET 重組1.將pSClOl-BAD-γ β α A (Gene Bridges GmbH)通過電轉化(1250V下電擊轉化) 轉化到細菌細胞中，然后將PCR產物和目標克隆分子共同電轉化到該細菌細胞中；2.緊接著將這些細菌轉化子在帶有不同抗生素篩選壓力的LB平板培養皿表面涂平板，并且在30°C細菌培養箱中過夜培養；3.第二天，用消毒的牙簽在平板上挑取所選取的陽性克隆，隨即將其移到1.5ml 的Ependorf管中，將菌株浸沒入其中的LB培養液中并多次旋轉，使細菌充分溶解在其中并且在30°C、1050rpm條件下培養；4.次日，將30μ1過夜培養的菌液加入到1.細1培養液中，并在30°C、1050Xg條件下培養2小時，至OD值為0. 2，然后向菌種加入20 μ 1 10 %的L-阿拉伯糖，緊接著在 37 0C、1050rpm 條件下培養 40min ；5.兩次在1200rpm，2°C，30秒離心，并用900 μ 1冰水清洗，6. 1300rpm、2°C下離心30秒，去除上清液，然后向其中加入PCR產物和目標克隆質粒，并且混合；7.將混合液加入到電轉化杯中，并在1350V的電壓下，進行電轉化；8.在電轉化杯中加入900 μ 1新鮮的LB培養液，然后將其全部移到1. 5ml的新的 Ependorf管中，并在37°C、1050rpm條件下培養1小時，然后在帶有不同抗生素的平板上涂平板，在37 °C培養箱中過夜培養。2. 3 Cre重組酶重組1.將 pSC101-BAD-cre 質粒(Gene Bridges GmbH)在 1350V 下電轉化到大腸桿菌菌中；2.電轉化后在電轉化杯中加入900 μ 1新鮮的LB培養液，并在30°C下1050Xrpm 震蕩培養90min ；3.將所培養的細菌在含有150 μ g/ml的氯霉素、氨芐青霉素和卡那霉素混合篩選壓力的LB培養皿上涂平板；4.在30°C細菌培養箱培養過夜培養；5.挑選單克隆菌株到Iml含有150 μ g/ml氨芐青霉素的培養液中，并在30°C下培養2-3小時；6.轉換培養溫度到37°C條件下過夜培養；7.提取質粒DNA并酶切消化，再通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定檢測。實施例1.基因被敲除的大腸桿菌JM109(WT)的構建使用因rpsL基因發生突變而具有鏈霉素抗性的大腸桿菌JM109野生型菌株 (JM1094trK，得自 Gene Bridges GmbH)，構建 rec/ET 基因被敲除(JM109_StrK-Δ recET，也稱為 4#JM109)以及 fhuA 基因被敲除(JM109-StrK- Δ recET- Δ fhuA,也稱為 ^JM109)的大腸桿菌菌株。為了從染色體組中將rec/ET基因敲除，通過引物1#和姊(AAATATTTCAAGTTG GCGGTGCATTACACCGCCAGGCTGAATACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCAGAAGAACTCGTCAA GAAGAAAGTTTCCATGGAAAAGAGAAG, SEQ ID NO 1 ；和 TGAACAAAACGAATTTTAATCTGAGTTGAGGTTA AAAAACATACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCACGCTGCCGCAAGCACTCAG, SEQ ID NO 2), 以質粒pBeloBACll-rpsL-neo-zeo(Gene Bridges)為模板，通過PCR擴增獲得含有卡那霉素抗性(neo基因)的rpsL-neo基因盒。按照上述的Red/ET重組的基本步驟，用fpsL-neo 基因盒替換染色體組中的rec/ET基因；同樣通過引物5#和6# (CTCGTTTACGTTATCATTCACTT TACATCAGAGATATACCATACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCACGCTGCCGCAAGCACTCA, SEQ ID NO :5 ；和 GAAGGTTGCGGTTGCAACGACCTGACGTTCTGCGCCCCAGAATACCGTTCGTATAATGTATGCTAT ACGAAGTTATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG, SEQ ID NO 6)，借助 red/ET 重組，用 rpsL-neo 基因盒進一步替換染色體組中的fhuA基因，得到具有卡那霉素抗性的菌株克隆。卡那霉素抗性克隆通過引物3i^P4#(GCCAGAAATGGCAGGTATTCG，SEQ ID NO 3 ；和TGGCTTTCACCGTTACTGATGG， SEQ ID NO 4)以及PCR可以擴增得到長度約為1.71Λ的DNA片段。按照2. 3所述的方法通過Cre/loxP特異性重組，該rpsL-neo基因盒在Cre酶的作用下被去除，最終只是在染色體組中遺留一個IoxP位點的序列，獲得具有鏈霉素抗性的克隆-菌株JM1094trK- Δ recET 和JM109-MrK- Δ recET- Δ fhuA。最終得到的克隆通過引物3#和4#及引物7#和 8# (CTCGTTTACGTTATCATTCAC, SEQ ID NO 7 ；和 GCCAACCAGCGAGATAGCTTC，SEQ ID NO 8)經 PCR擴增測定，原來rec/ET和fhuA基因位點處的擴增片段大小為585bp和584bp (見圖1和2)。與此相對比，以大腸桿菌JM109 (WT)作為模板，通過引物3#和4#及引物7#和8#并通過菌落PCR，可以得到長度分別為3. 9kb和2. 7kb的rec/ET和fhuA基因的擴增片段。這表明，大腸桿菌JM109 (WT)中的rec/ET (和fhuA)基因已被敲除。實施例2.多拷貝質粒pUC-cm-r印eats的構建構建多拷貝質粒pUC-cm-r印eats作為DNA穩定性的檢測系統。該質粒含有一個氨芐青霉素抗性(AmpK)基因、一個卡那霉素抗性(KmK)基因和兩個互不相連的缺失部分片段的氯霉素抗性(CmK)基因序列，其中卡那霉素抗性基因位于兩個缺失型CmK基因之間。pUC-cm-r印eats質粒(6648bp)在發生重組之前和重組之后(得到具有氯霉素抗性的pUC-cm-amp質粒)，始終含有氨芐青霉素抗性(AmpK)，因此帶有pUC-cm-r印eats質粒或者pUC-cm-amp (3668bp)質粒的大腸桿菌菌株可以在含有氨芐青霉素的LB平板上生長， 但只帶有pUC-cm-amp質粒的大腸桿菌菌株由于兩個缺失型CmK基因之間發生重組而獲得完整的CmK基因，可以在含有氯霉素的LB的平板上存活。該質粒如下制備。首先將pSClOl-BAD-γβ α A質粒(Gene Bridges GmbH)通過于 1250V下電轉化轉入 BG2005 菌株中。用引物 11# 和 12# (CATGGAGCGGCGTAACCGTCGCACAGGAAGGACAGAGAAACATGA TCGTGCTCCTGTCGTTG,SEQ ID NO 11 ；和TTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTCTTTA GTGAGGGTTAATTGCG, SEQ ID NO :12)，以 pUC18_amp (Gene Bridges GmbH)作為模板進行 PCR 擴增，獲得PCR產物。這些引物含有兩段與pBAC-cm-r印eats (即pBelo-BAC-rpsL-neo-new) 質粒中被截短的(CmK)氯霉素抗性基因同源的序列，使得可將pBAC-cm-r印eats中帶有被截短的CmK和KmK的片段通過同源重組而被亞克隆到pUC18-amp上。將pUC18-amp的 PCR產物和pBAC-cm-r印eats質粒(Gene Bridges GmbH)通過電轉化轉化到已經帶有 pSClOl-BAD-y β α A質粒的BG2005菌株中。在電轉化之后隨即發生Red/ET重組，得到質粒pUC-cm-r印eats。帶有pUC-cm-r印eats質粒的目標克隆菌株可以在含有AmpK和KmK的 LB細菌培養皿篩選得到。然后將這些目標克隆菌株進行質粒提取，并且用NcoI限制性內切酶消化和瓊脂糖凝膠電泳，其結果見圖3。實施例3.通過pBAC-cm-r印eats和pUC-cm-r印eats質粒的檢測系統進行DNA穩定性檢測試驗在該試驗中，將pBAC-cm-r印eats和pUC-cm-r印eats兩種質粒分別被轉化到8個不同的大腸桿菌菌株之中。經過預培養和主培養大腸桿菌菌株的數量達到其生長的飽和濃度(0D·值為3. 0)時，可用于DNA穩定性試驗。對于攜帶pBAC-cm-repeats質粒的菌株，在預培養時使用新霉素和卡那霉素兩種混合抗生素作為共同的篩選壓力，而在主培養過程中，只使用新霉素作為篩選壓力。這主要是為了有意去丟失Neo基因(卡那霉素抗性基因)，并誘導這兩個缺失型氯霉素抗性基因片段的同源區域發生重組，從而形成一個完整的且有功能的氯霉素抗性基因(CmK)。然后，將達到飽和濃度的菌株分別取等量的體積，涂布在只含有新霉素或只含有氯霉素的LB平板上，并在37°C (DTO80菌株在30°C條件下)細菌培養箱中培養。在只含有新霉素的LB平板上生長的菌落包括已經發生自發性同源重組的菌株和沒有發生自發性同源重組的菌株。在只含有氯霉素的LB平板上生長的菌落表現的是pBAC-cm-r印eats質粒的重組情況，這個重組發生在兩個不完整的缺失少部分序列的CmK基因的同源片段之間，故DNA穩定性由在這兩個含不同抗生素的LB平板上的菌落數的比值所指示。在無抗生素的LB平板上生長的菌落及其數量表示的是已被轉化的轉化子菌落和未被轉化的菌落的總數。而在帶有新霉素的LB平板上生長的菌落數表現的是 pBAC-cm-repeats和pUC-cm-r印eats質粒在轉化之后，成功發生轉化的轉化子的生長情況。轉化效率由這兩種平板上生長的菌落數的比值來指示。對于多拷貝檢測質粒pUC-cm-r印eats來說，該質粒含有AmpK和KmK (卡那霉素抗性)基因，而且KmK基因位于兩個不完整的缺失部分序列的0^基因片段之間。與 pBAC-cm-repeats質粒同樣的原理，先在氨芐青霉素和卡那霉素共同存在并在37°C的條件下進行預培養，然后主培養在只有氨芐青霉素存在且于37°C的條件下進行至飽和濃度 (DY380菌株在30°C條件下)。最后將等量體積的菌液100 μ 1分別涂平板于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB平板上，在其表面上生長的菌落數之間的比值代表了其DNA的穩定性。如上所述進行DNA穩定性檢測。在表1和2及圖5和6中可以清楚地看到，pBAC-cm-repeats的自發重組率在大腸桿菌JM109(WT)、 JM109-StrE- Δ recET- Δ fhuA (2#JM109) JM109-StrE- Δ recET (4#JM109)是最低的， 并且在 JM109-StrR-ArecET-AfhuA(2#JM109)禾Π JM109-StrE- Δ recET (4#JM109) 的自發重組率大約為在JM109(WT)中的一半。而BG2005菌株中的自發重組率是 JM109 (WT)的2倍；在BJ5183、HS996和HS996_gyrA96菌株中的自發重組率是在 JM109-StrE- Δ recET- Δ fhuA (2#JM109)和 JM109_StrK-Δ recET G#JM109)中的數倍；然而在DY380中的自發重組率最高，為0. 19112%。表1 檢測系統pBAC-cm-r印eats在不同菌株中DNA穩定性的原始數據
權利要求
1.一種細菌，其中一個或更多個重組酶基因被敲除。
2.權利要求1的細菌，其為大腸桿菌。
3.權利要求1的細菌，其來源于大腸桿菌JM109野生型菌株。
4.權利要求1-3任一項的細菌，其中Reda,Red^、RecE和RecT重組酶基因中的一個更多個被敲除。
5.權利要求1-4任一項的細菌，其中RecE和RecT重組酶基因中的一個或兩個被敲除。
6.權利要求1-5任一項的細菌，其中RecE和RecT重組酶基因皆被敲除。
7.權利要求1-6任一項的細菌，其中fhuA基因被進一步敲除。
8.權利要求1-7任一項的細菌，其具有鏈霉素抗性。
全文摘要
基因工程用工具菌及其應用。本申請涉及基因組中一個或多個重組酶基因被敲除的工程菌。所述工程菌尤其可用于克隆含有多個同源序列的基因或大片段DNA的工程菌。
文檔編號C12R1/19GK102344897SQ201110300048
公開日2012年2月8日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者于浩洋 申請人:蘇靜