專利名稱：一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法
技術領域：
本發明屬于黃芩的人工培育技術領域，涉及一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法。
背景技術：
毛狀根培養周期較長，在生物量大量增殖后，其培養液中溶解氧成為限制性因素， 影響毛狀根生長與次生代謝產物的合成，不利于工業化生產。氣升式生物反應器與鼓泡式生物反應器是毛狀根培養常用反應器，但較高的湍流剪切力是損害細胞、抑制毛狀根生長的重要原因，因此尋求一種改善毛狀根自身供氧狀況，促進毛狀根生長并提高次生代謝產物含量的方法，消除毛狀根培養后期出現的溶解氧限制問題，將會有力推進毛狀根生產次生代謝產物的工業化進程。透明顫菌中血紅蛋白(VHb)是由透明顫菌產生的一種可溶性血紅蛋白，這種血紅蛋白能在貧氧條件下被大量誘導合成，使攜帶該血紅蛋白基因的生物能在微氧條件下很好地生存。研究表明，透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)已在多種植物中表達成功，并表現出細胞生長和產物合成對溶氧的敏感度降低的性狀；轉的植物能夠提高抗澇能力及促進水培植物生長。
發明內容
本發明在于提供一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法，將Vgb基因在黃芩毛狀根中表達，改善黃芩毛狀根培養過程中對溶解氧需求。本發明是通過以下技術方案來實現一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法，包括以下步驟1)將Vgb基因克隆到植物表達載體中，再將該植物表達載體轉化農桿菌，篩選獲得整合了 Vgb的農桿菌菌株；2)將無菌的黃芩外植體或毛狀根接種于MS固體培養基上，25 黑暗條件下預培養2 3d ；在預培養的黃芩外植體或毛狀根上劃痕，加入經活化的整合了 Vgb的農桿菌，并添加濃度為10 200mg/L乙酰丁香酮，感染10 30min后，將黃芩外植體或毛狀根轉移到含10 50mg/L乙酰丁香酮的MS固體培養基上，25 黑暗培養2 3d，再轉移到含抗菌素的MS固體培養基上，25 ^TC黑暗培養，誘發毛狀根；3)待經農桿菌感染的黃芩外植體或毛狀根上長出的毛狀根達到2 3cm時，在無菌條件下切下毛狀根，將其轉移到含抗菌素的MS篩選培養基上，25 ^rc黑暗培養，直至農桿菌生長被抑制，然后切取毛狀根，獲得轉Vgb基因黃芩毛狀根；4)毛狀根的繼代培養將切取的轉vgb基因黃芩毛狀根接種于MS固體培養基上，25 避光培養，每 20天繼代培養一次；
5)毛狀根的液體培養選取MS固體培養基繼代培養2次以上、生長旺盛的毛狀根，接種到MS液體培養基上，50 100r/min振蕩、25 避光培養。所述的vgb基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的植物表達載體為PBI 121-vgb載體，該載體是vgb基因通過BaMHI和^icI 酶切位點，克隆到植物表達載體PBI 121中而獲得；所述的抗菌素為100 500mg/L的頭孢和50 100mg/L的卡那霉素。所述的農桿菌為發根農桿菌或根瘤農桿菌，發根農桿菌為R1000、15834、1. 2556、 A49615、A4野生型中的一種，根瘤農桿菌為GV 3101。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明公開的一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法，采用基因工程方法，通過農桿菌的轉化，將vgb導入黃芩毛狀根中，獲得的整合有vgb的黃芩毛狀根能夠在MS培養液中正常生長并有效合成次生代謝產物，同時對溶解氧需求較低。毛狀根培養周期較長，利用毛狀根工業化生產次生代謝產物時，發酵罐設備耗電與生產成本直接關聯。本發明獲得的整合有vgb的黃芩毛狀根能夠在低溶氧環境下正常生長，在工業化生產過程中間歇通氣即可滿足毛狀根需求，降低生產耗電、節約生產成本，本發明對推進毛狀根生產次生代謝產物的工業化進程有著重要意義。
圖1為雙酶切PBI 121-vgb質粒電泳圖；圖2為篩選的重組農桿菌中PBI 121-vgb質粒的PCR鑒定電泳圖；圖3為毛狀根中vgb基因PCR鑒定電泳圖。
具體實施例方式本發明公開一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法，利用含vgb的農桿菌菌液侵染黃芩外植體或毛狀根，誘導黃芩外植體或毛狀根獲得轉vgb的毛狀根，以降低黃芩毛狀根培養過程中對溶解氧需求。下面結合具體的獲得及培養方法對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。1、含有vgb植物表達載體的構建l)vgb片段的克隆vgb基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，可以在含有vgb的質粒載體上進行 PCR擴展，或者直接從商購的含有該基因片段的載體上剪切之后使用。根據vgb的序列設計擴增vgb的上弓丨物5-cgggatccatgttagaccagcaaacca-3,下弓丨物:5-cgagctcttattcaaccgcttgagc-3o2) vgb片段及PBI 121質粒載體的酶切采用雙酶切法(BamH I與Mc I限制酶)獲得vgb片段及PBI 121質粒載體，電泳，回收DNA。方法在20yL酶切反應體系中，加5yg vgb或0.5 l.Oyg PBI 121質粒載體和2μ L酶切反應緩沖液(由IOmM Tirs-HCl、5mM MgC12、0. 5mM 二硫蘇糖醇、50mM KCl組成)，加入2 IOu的限制性內切酶BaMHI 1 μ L，SacIl μ L，37°C保溫3h ；65°C保溫IOmin, 滅活限制酶；加入適量的加樣緩沖液，混勻，離心5s，分別上樣于瓊脂糖凝膠兩個樣品槽中，同時與最外側的樣品槽中加入1 μ g分子質量標準DNA樣品；3V/cm電泳1 池；切下 vgb片段及PBI 121質粒載體條帶，分別回收DNA。在 1.5mL Eppendorf 管中加 AddH2O IlyL, vgb 0. 4μ g, PBI 1210. 1 μ g, 10*buffer 2μ L，T4連接酶Iu ；混勻，瞬時離心；14°C連接4 16h。雙酶切檢測連接產物，檢測電泳結果如圖1所示，其中泳道從左到右依次為 Maker、PBI 121-vgb載體、商購的含vgb的質粒載體PCR作為對照，可以看到PBI 121-vgb 載體被雙酶切之后，形成了兩個目的條帶，結果表明vgb片段克隆到了 PBI 121質粒載體預設的位點上，PBI 121-vgb載體構建成功。2、含有vgb植物表達載體發根農桿菌的制備1)將 PBI 121-vgb 載體轉化 E. coli，通過培養 E. coli，收集 PBI 121-vgb 載體。方法在100 μ L Ε. coli DH5 α感受態細胞中，加入20ng PBI 121-vgb質粒載體， 輕輕振蕩混勻；冰浴30min，42°C熱激90s，然后冰浴2 5min ；再加入800 μ L LB培養液， 37°C下振蕩培養Ih左右；取200 500 μ L菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養 14 施；挑取單菌落接種于含50mg/L卡那霉素的3mL LB培養液中，37°C振蕩培養過夜；將過夜培養菌液轉移到1. 5mL Eppendorf管中，12000rpm離心30s，收集菌體沉淀，盡量棄凈
上清；力口入 IOOyL 溶液 I (50mmol/L Glucose, 25mmol/L Tris-HCl, lOmmol/LEDTA, ρΗ8· 0)，劇烈振蕩，室溫靜置IOmin ；加入200 μ L溶液II (0. 2mol/LNa0H, 1 % SDS)，快速顛倒離心管5次，冰浴靜置5min ；加入150 μ L預冷的溶液III(3mol/L KCl,5mol/L HAc, ρΗ5· 2)，混勻，冰浴，靜置IOmin ；室溫12000rpm離心2min，取上層水相于另一新Eppendorf管中，加入等體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1)，振蕩混勻；室溫12000rpm離心aiiin，取上層水相于另一新Eppendorf管中，加入0. 8倍體積的異丙醇或2. 5倍體積的乙醇，混勻，靜置5min ；室溫 12000rpm離心lOmin，棄上清；用70%乙醇洗兩次，空氣干燥5 IOmin ；收集PBI 121-vgb 載體并溶于50 μ L去離子水或TE (ρΗ8. 0)中備用；2) PBI 121-vgb載體轉染農桿菌農桿菌具體采用發根農桿菌或根瘤農桿菌GV 3101，發根農桿菌為R1000、15834、 1. 2556、A49615 或 A4 野生型。挑取農桿菌單菌落，接種于5 IOmL YEB液體培養基中，28°C振蕩培養至對數生長期，OD600約0. 5 ；將菌液轉移到1. 5mL Eppendorf管中，冰浴靜置lOmin, 12000rpm離心 2min,收集菌體；用1. 5mL 0. 5M NaCl懸浮冰浴20min, 12000rpm離心2min，收集菌體；加100 μ L 20mM CaCl2 重懸農桿菌的菌體，加入 10 μ L PBI 121-vgb，冰浴 30min, 液氮中3min，37°C水浴5min，加入0. 5mL YEB培養液IlOrpm培養過夜；取200 500 μ L菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素的YEB平板上，倒置培養14 16h ；挑取轉化的農桿菌單菌落接種于含50mg/L卡那霉素的YEB液體培養基中，280C IlOrpm搖培16h，直接用菌液做PCR。具體采用雙引物擴增vgb片段，合成如下引物對 P的序列上弓I物:cgggatccat gttagaccag CciciciCCci f下弓I物:cgagctctta ttcaaccgct tgagc ；反應體系25 μ L 10氺PCR 反應緩沖液 2. 5 μ L, dNTP (各 IOmM) l.OyL, Taq 酶 1U，引物(10 μ M)各 1. 5 μ L，模板 2. 0 μ L，H2O 15. 5 μ L ；反應程序95"C 5min, 94 "C 30s, 44 "C 30s, 72 "C lmin,循環 30 次，72 "C 5min, 4°C lmin。擴增產物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測；結果如圖2所示，可以看到所擴增產物為470bp左右的目的片段，這表明vgb基因已經成功的整合到了農桿菌當中。轉染了 PBI 121-vgb載體的農桿菌在-20°C甘油中保存備用。3、農桿菌介導vgb轉化黃芩獲得轉基因黃芩毛狀根1)外植體預培養將無菌的黃芩外植體或毛狀根接種于MS固體培養基上，25 ^TC黑暗條件下預培養2 3d ；2)毛狀根的誘導在預培養的黃芩外植體或毛狀根上劃痕，加入經活化的整合了 vgb的農桿菌的菌液，并添加濃度為10 200mg/L乙酰丁香酮，感染10 30min后，將黃芩外植體或毛狀根轉移到含10 50mg/L乙酰丁香酮的MS固體培養基上，25 黑暗培養2 3d，再轉移到含100 500mg/L頭孢和50 100mg/L卡那霉素的MS固體培養基上，25 黑暗培養，誘發毛狀根；3)毛狀根的脫菌培養待經農桿菌感染的黃芩外植體或毛狀根上長出的毛狀根達到2 3cm時，在無菌條件下切下毛狀根，將其轉移到含100 500mg/L頭孢和50 100mg/L卡那霉素的MS篩選培養基上，25 ^TC黑暗培養，直至農桿菌生長被抑制，切取毛狀根，獲得轉基因黃芩毛狀根；4)毛狀根的繼代培養將切取的轉基因黃芩毛狀根接種于MS固體培養基上，25 ^TC避光培養，每20 天繼代培養一次；5)毛狀根的液體培養選取MS固體培養基繼代培養2次以上、生長旺盛的毛狀根，接種到MS液體培養基上，50 100r/min振蕩、25 避光培養。4、轉染vgb的黃芩毛狀根的鑒定提取傳代2次以上的黃芩毛狀根的DNA并以獲得的cDNA為模板，以引物對P為擴增引物，PCR檢測轉基因黃芩毛狀根vgb，檢測結果如圖3所示，其中泳道從左到右依次為 Maker、黃芩毛狀根vgb、含vgb的農桿菌，可以看到vgb的目的條帶穩定的整合到黃芩毛狀根上。獲得的整合有vgb的黃芩毛狀根能夠在MS培養液中正常生長并有效合成次生代謝產物、同時對溶解氧需求較低。由于毛狀根可以在低溶氧環境下正常生長，在發酵罐培養毛狀根時間歇通氣即可滿足毛狀根需求，而發酵罐設備耗電與生產成本直接關聯，這樣重組后的黃芩毛狀根的培養就達到了降低生產耗電、節約生產成本的目的。
權利要求
1.一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將Vgb基因克隆到植物表達載體中，再將該植物表達載體轉化農桿菌，篩選獲得整合了 vgb的農桿菌菌株；2)將無菌的黃芩外植體或毛狀根接種于MS固體培養基上，25 ^TC黑暗條件下預培養2 3d ；在預培養的黃芩外植體或毛狀根上劃痕，加入經活化的整合了 vgb的農桿菌，并添加濃度為10 200mg/L乙酰丁香酮，感染10 30min后，將黃芩外植體或毛狀根轉移到含 10 50mg/L乙酰丁香酮的MS固體培養基上，25 黑暗培養2 3d，再轉移到含抗菌素的MS固體培養基上，25 ^rc黑暗培養，誘發毛狀根；3)待經農桿菌感染的黃芩外植體或毛狀根上長出的毛狀根達到2 3cm時，在無菌條件下切下毛狀根，將其轉移到含抗菌素的MS篩選培養基上，25 ^TC黑暗培養，直至農桿菌生長被抑制，然后切取毛狀根，獲得轉vgb基因黃芩毛狀根；4)毛狀根的繼代培養將切取的轉vgb基因黃芩毛狀根接種于MS固體培養基上，25 ^TC避光培養，每20 天繼代培養一次；5)毛狀根的液體培養選取MS固體培養基繼代培養2次以上、生長旺盛的毛狀根，接種到MS液體培養基上， 50 100r/min振蕩、25 避光培養。
2.如權利要求1所述的一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法，其特征在于，所述的 vgb基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3.如權利要求1所述的一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法，其特征在于，所述的植物表達載體為PBI 121-vgb載體，該載體是vgb基因通過BaMHI和McI酶切位點，克隆到植物表達載體PBI 121中而獲得；所述的抗菌素為100 500mg/L的頭孢和50 100mg/L的卡那霉素。
4.如權利要求1所述的一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法，其特征在于，所述的農桿菌為發根農桿菌或根瘤農桿菌，發根農桿菌為R1000、15834、1. 2556、A49615、A4野生型中的一種，根瘤農桿菌為GV 3101。
全文摘要
本發明涉及一種提高黃芩毛狀根抗低氧能力的方法。本發明是通過構建含血紅蛋白基因的植物表達載體，經農桿菌介導轉化黃芩外植體或毛狀根獲得轉基因黃芩毛狀根。本發明獲得的整合有vgb的黃芩毛狀根能夠在低溶氧環境下正常生長，在工業化生產過程中間歇通氣即可滿足毛狀根需求，降低生產耗電、節約生產成本，本發明對培養黃芩毛狀根生產黃芩藥用成分、推進毛狀根生產次生代謝產物的工業化進程有著重要意義。
文檔編號C12N15/82GK102352376SQ20111029991
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者李雅, 錢衛東, 齊香君 申請人:陜西科技大學