專利名稱：低甲基化基因elfn2的應用方法
技術領域：
本發明涉及低甲基化基因ELFN2在制備腦膠質瘤病人預后預測試劑中的應用。
背景技術：
腦膠質瘤是人類中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，約占神經系統腫瘤的40. 49%。 盡管目前采用手術治療聯合化療和放療的方法，膠質瘤病人的預后仍非常差。據報道，膠質瘤病人的5年生存率低于25%，而膠質瘤母細胞瘤的病人總生存時間平均為12. 3個月。目前，對腦膠質瘤的預后判定沒有參考標準，也沒有特異性的指標，遠遠不能適應對人腦膠質瘤進行預后判定的需求。因此，對人腦膠質瘤進行預后判定，以便選擇最佳治療方案，顯著提高患者生存率，一直是科學研究亟待解決的重要課題。表觀遺傳機制，包括高/低甲基化、組蛋白修飾或非編碼RNA表達在腫瘤的形成過程中發揮著重要作用。DNA甲基化狀態的改變是腫瘤發生發展過程中的重要標志，而低甲基化在多種腫瘤形成中起著非常重要的作用，其中包括腦膠質瘤。DNA低甲基化可導致基因表達增加，從而促進腫瘤的發生和發展，如胃癌中R-Ras、cyclin D2及maspin ；黑色素瘤中MAGE ；結腸癌中S100A4等基因。近年來，以DNA甲基化為代表的腫瘤表觀遺傳學及其在臨床診斷、化療敏感性和預后評價等方面的應用價值，已經愈來愈受到研究者的重視。FENl 基因啟動子低甲基化導致其在乳腺癌中高表達，并且其低甲基化狀態與預后相關。PRAME基因在神經母細胞瘤、乳腺癌及卵巢腺癌中因低甲基化而高表達，PRAME低甲基化病人預后更差。LlCAM CpG島低甲基化致其在結直腸癌中表達增加，且與腫瘤進展相關。⑶H3基因在結直腸癌中低甲基化，與腫瘤分級相關。由此可見，基因低甲基化在探尋腫瘤分子標志物方面具有巨大潛力。利用亞硫酸氫鹽測序PCR法(BSP)分析所獲得的腫瘤特異性甲基化狀態，是甲基化分析的金標準，它能明確所測區域每一個CG位點的甲基化狀態。ELFN2 基因(Extracellular leucine-rich repeat and fibronectin type III domain containing〗)定位于染色體 22ql3. 1，GeneBank 登錄號NM_052906。ELFN2 在腦組織各個區域的軸突中有表達。申請人的研究表明該基因在腦組織、肝組織中表達，在腦膠質瘤、肝細胞癌中表達上調，在部分纖維結締組織中表達，而在肺組織和結腸粘膜及其來源的腫瘤中不表達(見圖1)。免疫組織化學法檢測ELFN2蛋白在正常腦組織及腦膠質瘤組織中的表達，結果顯示ELFN2在膠質瘤中表達增加(圖1)。亞硫酸氫鹽測序PCR結果顯示， ELFN2在膠質瘤中發生低甲基化。并用SPSS 13. 0軟件對ELFN2蛋白表達與ELFN2基因低甲基化進行相關性分析，結果表明兩者間存在相關性(P < 0. 01)，說明表觀遺傳學可能參與了 ELFN2基因的表達調控。
發明內容
本發明的目的是提供一種低甲基化基因ELFN2的應用方法，對于腦膠質瘤的預后預測具有重要意義。
低甲基化基因ELFN2用于制備腦膠質瘤診斷、預測、檢測或篩查制劑；特別是用于制備腦膠質瘤診斷、預測、檢測或篩查的試劑盒。如用于制備亞硫酸氫鹽直接測序法預測腦膠質瘤的制劑；所述的制劑中包括 根據ELFN2基因啟動子區CpG島設計的，采用亞硫酸氫鹽直接測序法的引物序列為F 5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3‘，R 5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3‘。一種用于人腦膠質瘤預后預測的ELFN2基因啟動子區甲基化檢測試劑盒，包括以下引物F 5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3‘，R 5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3‘。申請人:發現ELFN2基因在腦膠質瘤組織中表達上調(圖1)。ELFN2轉錄起始位點上游-788至-114bp為一典型的CpG島(圖2)，該CpG島中CG位點在正常的腦組織中均處于高甲基化狀態，而在ELFN2表達上調的腦膠質瘤組織中其甲基化程度降低(部分結果見圖3)。ELFN2低甲基化的膠質瘤病人總生存率明顯低于高甲基化的病人(圖4)，提示ELFN2 基因是膠質瘤中的低甲基化基因，是預測膠質瘤預后的分子標志。本發明為腦膠質瘤預后預測提供了強有力的技術支持和分子生物學基礎，具有深遠的臨床意義和推廣性。申請人:在上述研究基礎上，制備了用于人腦膠質瘤預后預測的ELFN2基因啟動子區甲基化檢測試劑盒。該試劑盒包括ELFN2啟動子區亞硫酸氫鹽測序PCR試劑盒及用于檢測ELFN2基因啟動子區甲基化狀態的引物。
圖1為ELFN2蛋白在多種組織及腫瘤中的表達；A 結腸粘膜；B 結腸腺癌；C 肺組織；D 肺癌；E 肝組織；F 肝細胞癌；G 腦組織；H 膠質瘤(I級)。其中A-F的放大倍數為10X20，G和H的放大倍數為10X40 ；圖2為ELFN2基因啟動子區_788bp至_114bp為一典型的CpG島；淺藍色區域為CpG島，橫坐標下紅色豎線為CG位點；圖3為正常腦組織和膠質瘤組織中ELFN2基因啟動子區甲基化狀態的檢測結果；圖中所示為部分結果，N2 第2例正常腦組織；N4 第4例正常腦組織；T2 第2例膠質瘤組織；T6 第6例膠質瘤組織。〇表示非甲基化位點， 表示甲基化位點，每一行表示一個克隆中所有CG位點的甲基化狀態，計算5個克隆中的甲基化比率進行比較。結果表明，正常腦組織中ELFN2基因啟動子區CpG島為高甲基化狀態，而膠質瘤組織中該CpG島發生低甲基化；圖4ELFN2啟動子低甲基化與膠質瘤病人預后的關系圖。綠色曲線表示ELFN2基因啟動子甲基化的膠質瘤病人的生存狀況及時間，藍色曲線表示ELFN2基因啟動子發生低甲基化的膠質瘤病人的生存狀況及時間。用SPSS 13. 0軟件進行Kaplan-Meier檢驗，差異有統計學意義(p = 0. 030)，說明ELFN2低甲基化的病人預后較高甲基化的病人差。
具體實施方式
以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。實施例1 米用 Promoterscan, Genomatix Promoter Inspector 及 CpGplot 等生物信息學軟件對ELFN2基因5’端序列進行生物信息學分析，結果表明ELFN2基因的啟動子區域可能位于_1037bp至-219bp處(以起始密碼子ATG中A為+1)。Methl primer express軟件和在線軟件Methprimer分析ELFN2啟動子預測區域_1037bp至_219bp，結果顯示為一 CpG 島，設計并合成ELFN2啟動子區的甲基化引物，5 ‘ AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3' (F)， 5‘ AACAACTCCTCACCCAAATC 3' (R)，對10例正常腦組織進行經亞硫酸鹽處理后的基因組測序(BSP)，發現ELFN2基因啟動子CpG島中CpG位點在正常的腦組織均處于甲基化狀態。 同時對不同級別腦膠質瘤組織標本(I級6例，II級20例，III級12例，IV級12例)50例， 進行了 ELFN2啟動子區甲基化狀態的檢測，發現82%的腦膠質瘤組織中ELFN2的啟動子區發生低甲基化，與正常腦組織比較，差異有統計學意義(P < 0. 05)，各級膠質瘤的ELFN2啟動子區甲基化水平沒有明顯的差異(P > 0.05)(見表1)。ELFN2啟動子區低甲基化的病人預后較甲基化病人的差，差異有統計學意義(P = 0. 030)。以上研究結果提示，ELFN2基因是一個新發現的腦膠質瘤甲基化基因，是一個膠質瘤預后預測標志。操作步驟(一 )亞硫酸氫鹽修飾樣品gDNA制備選擇已商品化的亞硫酸氫鹽修飾試劑盒。( 二)亞硫酸氫鹽直接測序PCR (BSP)試劑盒的使用內容該試劑盒包括用于檢測ELFN2基因啟動子區甲基化的PCR引物5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3' (F)5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3' (R)PCR擴增體系(_20°C保存)原理利用BSP引物進行PCR擴增ELFN2啟動子區CpG島。步驟1取經亞硫酸氫鹽修飾后的樣品gDNA4 μ 1 (總量約IOOng)，加入含甲基化引物 2 μ 1 的 PCR 擴增體系(50 μ 1)，使用 Takara 公司的 EmeraldAmp PCR Master Mix (含 DNA 聚合酶、緩沖液及dNTP混合物)進行擴增。PCR擴增體系為
EmeraldAmp PCR Master Mix 25μ DNA (25ng/pl)4μ1甲基化引物(20ηΜ)2μ1
H2O19μ1
總體系50μ1 2加樣后，置PCR儀進行PCR擴增，反應條件如下
權利要求
1.低甲基化基因ELFN2的應用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因ELFN2用于制備腦膠質瘤診斷、預測、檢測或篩查制劑。
2.根據權利要求1所述的應用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因ELFN2用于制備腦膠質瘤診斷、預測、檢測或篩查的試劑盒。
3.根據權利要求1所述的應用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因ELFN2用于制備亞硫酸氫鹽直接測序法預測腦膠質瘤的制劑。
4.根據權利要求1或3所述的應用方法，其特征在于，所述的制劑中包括根據ELFN2 基因啟動子區CpG島設計的，采用亞硫酸氫鹽直接測序法的引物序列為F 5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3‘， R 5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3‘。
5.一種用于人腦膠質瘤預后預測的ELFN2基因啟動子區甲基化檢測試劑盒，其特征在于，包括以下引物F 5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3‘， R 5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3‘。
全文摘要
本發明涉及低甲基化基因ELFN2的應用，即用于制備腦膠質瘤診斷、預測、檢測或篩查制劑。特別是用于制備亞硫酸氫鹽直接測序法預測腦膠質瘤預后的制劑。通過研究證實ELFN2在膠質瘤組織中因啟動子發生低甲基化而高表達，將檢測ELFN2基因低甲基化應用于膠質瘤預后預測，為預測膠質瘤病人的預后提供強有力的分子生物學依據，具有深遠的臨床意義和推廣性。
文檔編號C12Q1/68GK102352412SQ20111029928
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者余志斌, 劉曉萍, 卞艷慧, 唐海林, 李桂源, 武明花, 王澤友 申請人:中南大學