專利名稱：一種發酵培養微生物的方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物培養方法，尤其是一種適用于芽孢桿菌的培養方法。
背景技術：
在微生物領域，常常涉及到菌種的培養、增殖，使菌株在一定的溫度條件下、在適宜的培養基中增殖以擴大數量，滿足該菌種在人用藥、獸用藥、飼料、養殖等領域的使用需要。尤其是對于芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、酪酸梭菌等，都需要在發酵罐內進行發酵、增殖，使活菌數量顯著增加。根據微生物生命周期理論，微生物生長過程可分為適應期、對數生長期、平衡期、 死亡期。平衡期后的微生物因生長過程中底物濃度的降低、代謝產物的抑制、PH值的變化等生長環境的惡化及自身遺傳特性的影響導致微生物生長繁殖受到抑制，活菌數量開始減少，最終大量死亡。目前，國內芽孢桿菌(如，酪酸梭菌)發酵主要采用傳統的分批低密度法發酵，該方法具有發酵液菌濃度低、菌粉活菌數不高，發酵系數低，產量低，能耗高，成本高等缺點。
發明內容
本發明針對現有技術中微生物發酵主要采用傳統的分批低密度法發酵方法存在的發酵液菌濃度低、菌粉活菌數不高，發酵系數低，產量低，能耗高，成本高等不足，提供一種發酵培養微生物的方法；該方法能大幅度提高芽孢桿菌(如酪酸梭菌)發酵液活菌數、大幅度提高發酵系數和產品質量，大大降低能耗和生產成本。本發明的技術方案一種發酵培養微生物的方法，其特征在于包含如下工藝步驟
(1)選擇合適的芽孢桿菌生產種子，采用常規的分離純化處理，使菌種活化；
(2)一級種子培養將活化后的芽孢桿菌菌種接種至一級種子液體培養基中，30-40°C 培養6-24小時；
(3)一級種子液熱處理對步驟(2)所得的一級種子液進行熱處理處理溫度60— 90°C，時間5—60分鐘；
(4)二級種子培養將熱處理后的一級種子接入二級種子液體培養基中，30-40°C培養 6-24小時；
(5)二級種子液熱處理對步驟(4)所得的二級種子液進行熱處理處理溫度60— 90°C，時間5—60分鐘；
(6)三級種子培養將熱處理后的二級種子接入三級種子液體培養基中，30-40°C培養 6-24小時；
(7)三級種子液熱處理對步驟(6)所得的三級種子液進行熱處理處理溫度60—90°C，時間5—60分鐘；
(8)三級種子液冷處理對步驟(7)中熱處理后的三級種子進行冷處理處理溫度2— 25°C，時間6—48小時；
(9)發酵培養將步驟(8)中進行了冷處理的三級種子接入液體培養基中，在發酵罐內培養16-36小時，使其活菌數及芽孢數量倍增；并根據動態檢測發酵培養過程中的實時數據，實時向發酵罐內補充液體培養基和/或堿，發酵培養過程中的實時數據主要包括溫度、 C02濃度、pH值、殘糖、菌濃度、溶氧等；加入的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水中的一種，或兩種以上的混合物。(10)對步驟(9)中發酵液進行常規的離心分離、干燥，即得菌粉。以上所述的液體培養基，指一級、二級、三級種子液體培養基，其包括如下重量百分比的組分蛋白胨0. 2%—3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氫鉀 0. 01%—0. 5%，硫酸鎂 0. 01%—0. 5%，其余為水。液體培養基的另外一種配方，其包括如下重量百分比的組分蛋白胨0.2%— 3. 0%，月示蛋白胨0. 1-3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氫鉀0. 01%— 0. 5%，磷酸氫二鉀0. 01-0. 05%，硫酸鎂0. 01%—0. 5%，碳酸鈣0. 01-2. 0 %，其余為水。本發明根據微生物的生長規律，通過選育優良種子、改善生長環境、提高種子對菌群密度的適應能力達到較高的發酵液菌濃度。通過連續補料維持生長的最適底物濃度；通過連續補堿保證芽孢桿菌(酪酸梭菌)生長的最適PH值；通過發酵過程在線檢測與控制系統維持芽孢桿菌(酪酸梭菌)生長的最適環境條件(溫度、壓力、厭氧等)。從而保證發酵得到的菌液菌濃度達到較高的水平。本發明的一種發酵培養微生物的方法，具有如下優點
1、大幅度提高發酵液活菌數(提高10倍)，大幅度提高發酵系數(提高10倍)，產量高， 能耗低，成本低，產品質量標準提高5倍。2、實現操作簡單、工藝靈活操作，大大減少染菌、菌種退化等問題，整個發酵過程實現優化控制，目的產物轉化率大大提高。3、種子經過熱處理和冷處理后發酵培養過程中微生物實現同步生長，所獲得的菌粉活菌數高，芽孢成熟快，芽孢轉化率高，發酵水平高，活菌收率高，活菌成活率高。4、本發明能促進我國微生態藥物工業的發展，進而為患者減輕醫療負擔，提高人民生活質量和水平。
具體實施例方式本發明一種發酵培養微生物的方法，其包含如下工藝步驟
1、按照工藝要求，選擇合適的芽孢桿菌生產種子，采用常規的分離純化處理，使菌種活化、復蘇；
2、一級種子培養將活化后的芽孢桿菌菌種接種至一級種子液體培養基中，30-40°C培養6-24小時；
3、一級種子液熱處理對步驟2所得的一級種子液進行熱處理處理溫度60—90°C，時間5 — 60分鐘；熱處理的作用，增加微生物生長的同步性、提高微生物對較高溫度的適應能力，選得的菌種更耐高溫，不能適應高溫的菌種被淘汰；
4、二級種子培養將熱處理后的一級種子接入二級種子液體培養基中，30-40°C培養 6-24小時；
5、二級種子液熱處理對步驟4所得的二級種子液進行熱處理處理溫度60—90°C，時間5 — 60分鐘；
6、三級種子培養將熱處理后的二級種子接入三級種子液體培養基中，30-40°C培養 6-24小時；
7、三級種子液熱處理對步驟6所得的三級種子液進行熱處理處理溫度60—90°C，時間5 — 60分鐘；
8、三級種子液冷處理對步驟7中熱處理后的三級種子進行冷處理處理溫度2— 25°C，時間6— 48小時；
冷處理的作用，增加微生物生長的同步性、提高微生物對較低溫度的適應能力，選得的菌種更耐低溫，不能適應低溫的菌種被淘汰；
菌種經過熱處理和冷處理，在發酵培養過程中微生物實現同步生長，所獲得的菌粉活菌數高，芽孢成熟快，芽孢轉化率高，發酵水平高，活菌收率高，活菌成活率高，酪酸梭菌活菌膠囊活菌數提高5倍。9、發酵培養將步驟8中進行了冷處理的三級種子接入液體培養基中，在發酵罐內培養16-36小時，使其活菌數及芽孢數量倍增；并根據動態檢測發酵培養過程中的實時數據，實時向發酵罐內補充液體培養基和/或堿，發酵培養過程中的實時數據主要包括溫度、C02濃度、pH值、殘糖、菌濃度、溶氧等，都是發酵培養過程中的常規指標和數據；
發酵罐內的溫度在30— 45°C，最佳溫度為37°C ；
在發酵過程中，需要進行發酵過程PH值在線監測與控制、發酵過程C02在線監測、發酵過程溶氧在線監測系統、發酵過程溫度、壓力在線監測與控制、發酵過程氧化還原電位在線監測與控制，獲得發酵罐內的實時數據，根據實時數據向發酵罐內連續或斷續(而且實時) 補充液體培養基和/或堿；滿足工藝要求的保持充足但又較低濃度的營養物的需要。加入的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水中的一種，或兩種以上的混合物。10、對步驟9中進行發酵處理后的發酵液進行常規的離心分離、干燥，即得菌粉。所述的一級、二級、三級種子液體培養基，可以選用現有技術中適合芽孢桿菌的液體培養基；本發明提供兩種具體的、區別于現有技術的液體培養基，其包括如下重量百分比的組分
蛋白胨0. 2%—3. 0%,，酵母膏0. 3%—2. 0%,葡萄糖0. 3%—5. 5%,磷酸二氫鉀0. 01%— 0. 5%，硫酸鎂0. 01%—0. 5%，其余為水。液體培養基的另外一個配方為蛋白胨0. 2%—3. 0%，月示蛋白胨0. 1-3. 0%，酵母膏 0. 3%—2. 0%,葡萄糖 0. 3%—5. 5%,磷酸二氫鉀 0. 01%—0. 5%,磷酸氫二鉀 0. 01-0. 05%,硫酸鎂0. 01%—0. 5%，碳酸鈣0. 01-2. 0 %，其余為水。本發明采用的高密度發酵技術(High cell density culture,簡稱HCDC)，實際上就是指補料分批發酵，該技術是在分批培養的前提下，連續或按某一規律向發酵系統中補充營養物，使發酵系統保持充足但又較低濃度的營養物，其優點在于消除了快速利用碳源后造成阻遏效應，避免了抑制性副產物的積累，避免了菌體快速生長而造成質粒不穩定的問題。該技術替代傳統發酵工藝進行芽孢桿菌(酪酸梭菌)的工業化生產，能實現酪酸梭菌發酵液活菌數提高10倍，發酵系數提高10倍，產品質量標準提高5倍，大大降低能耗和生產成本，從而推動人體腸道益生菌的市場競爭能力，促進我國微生態藥物工業的發展，進而為患者減輕醫療負擔，提高人民生活質量和水平。
權利要求
1.一種發酵培養微生物的方法，其特征在于包含如下工藝步驟(1)選擇合適的芽孢桿菌生產種子，采用常規的分離純化處理，使菌種活化；(2)一級種子培養將活化后的芽孢桿菌菌種接種至一級種子液體培養基中，30-40°C 培養6-24小時；(3)一級種子液熱處理對步驟(2)所得的一級種子液進行熱處理處理溫度60— 90°C，時間5—60分鐘；(4)二級種子培養將熱處理后的一級種子接入二級種子液體培養基中，30-40°C培養 6-24小時；(5)二級種子液熱處理對步驟(4)所得的二級種子液進行熱處理處理溫度60— 90°C，時間5—60分鐘；(6)三級種子培養將熱處理后的二級種子接入三級種子液體培養基中，30-40°C培養 6-24小時；(7)三級種子液熱處理對步驟(6)所得的三級種子液進行熱處理處理溫度60— 90°C，時間5—60分鐘；(8)三級種子液冷處理對步驟(7)中熱處理后的三級種子進行冷處理處理溫度2— 25°C，時間6—48小時；(9)發酵培養將步驟(8)中進行了冷處理的三級種子接入液體培養基中，在發酵罐內培養16-36小時，使其活菌數及芽孢數量倍增；并根據動態檢測發酵培養過程中的實時數據，實時向發酵罐內補充液體培養基和/或堿；(10)對步驟(9)中發酵液進行離心分離、干燥，即得菌粉。
2.根據權利要求1所述發酵培養微生物的方法，其特征在于所述的液體培養基，其包括如下重量百分比的組分蛋白胨0. 2%—3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氫鉀0. 01%—0. 5%，硫酸鎂0. 01%—0. 5%，其余為水。
3.根據權利要求1或2所述發酵培養微生物的方法，其特征在于所述的液體培養基， 蛋白胨0. 2%—3. 0%，月示蛋白胨0. 1-3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氫鉀 0. 01%—0. 5%,磷酸氫二鉀 0. 01-0. 05%,硫酸鎂 0. 01%—0. 5%,碳酸鈣 0. 01-2. 0 %，其余為水。
4.根據權利要求1或2所述發酵培養微生物的方法，其特征在于所述的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水中的一種，或兩種或兩種以上的混合物。
全文摘要
本發明公開了一種發酵培養微生物的方法，其工藝步驟為對合適的芽孢桿菌生產種子經一級種子培養后熱處理，處理溫度60—90℃，時間5—60分鐘；二級種子培養后熱處理三級種子培養后熱處理和冷處理進行了冷處理的三級種子接入液體培養基中，在發酵罐內培養16-36小時；并根據動態檢測發酵培養過程中的實時數據，實時向發酵罐內補充液體培養基和/或堿。本發明的方法，大幅度提高發酵液活菌數、發酵系數，產量高，能耗低，成本低，產品質量標準提高；種子經過熱處理和冷處理后發酵培養過程中微生物實現同步生長，所獲得的菌粉活菌數高，芽孢成熟快，芽孢轉化率高，發酵水平高，活菌收率高，活菌成活率高。
文檔編號C12N1/20GK102337238SQ201110297489
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者尚玉新, 江蘇華 申請人:重慶泰平藥業有限公司