美白袪斑中藥復方提取物的制備及應用的制作方法

專利名稱：美白袪斑中藥復方提取物的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥復方提取物，具體是涉及一種采用二氧化碳超臨界萃取技術和大孔吸附樹脂富集技術，以白花敗醬草、文冠果種仁、白鮮皮、仙鶴草、紅景天、決明子、柏子仁、金蕎麥、薄荷、甘草為原料制得的提取物，該提取物具有明顯的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用。本發明還涉及了該提取物在制備美白袪班的藥物制劑、保健食品和化妝品中的應用。
背景技術：
愛美之心，人皆有之。隨著生活水平的提高，人們對生活質量的要求越來越高，越來越重視皮膚的自然美白，而顏面部顯得尤為重要。黃褐斑是一種獲得性色素沉著皮膚病， 是由多種原因所致的局限性、不規則性皮膚色素改變，臨床表現為對稱性色素沉著，呈蝶翅狀，輕者為淡黃或淺褐色，點片狀散布于面頰兩側，以眼部下外側多發；重者呈深褐或淺黑色分布于面部。本病多發于中青年女性，一般無任何自覺癥狀，病程頑固，嚴重影響患者美觀，給患者精神和生活方面帶來諸多煩惱和痛苦。黃褐斑發病機理復雜，黑素過多是其核心病理表現。其確切的發病機制迄今未明， 一般認為與黑素代謝異常、內分泌失調、妊娠、口服避孕藥、遺傳因素、氧自由基、紫外線照射、酪氨酸酶功能障礙等諸多因素有關，其中內分泌失調、遺傳、紫外線照射等造成的皮膚黑素代謝異常是其發病的主要原因。現代醫學治療黃褐斑主要包括使用避光劑(如氧化鋅、二氧化鈦等)，系統使用維生素類、止血環酸、褪黑素等；但基本以局部外用化學脫色為主，如氫酮、壬二酸、曲酸、谷胱甘肽、消炎痛、維甲酸、酚類化合物、皮質內固醇等；還有化學剝脫角質層或化學皮膚沙磨去除黑素及用染料激光破壞黑素顆粒等。可是，大多數方法因引起不均勻色素脫失、毛細血管擴張、接觸性皮炎等毒副作用或本身不穩定、療效緩慢易復發，并有造成永久脫色和藥源性褐黃斑之弊，而未能推廣應用。中醫學將黃褐斑稱作“黧黑斑”、“面塵”、“肝斑”等，《醫宗金鑒》云“黯如塵久怠暗，原于憂思抑郁而成”。對本病的癥狀又云“初起色如塵垢，日久黑似煤形，枯暗不澤，大小不一。小者如粟粒赤豆，大者似蓮子、或長、或斜、或圓。與皮膚相平，婦女多有之”。認為肝、腎、脾功能失調，氣血運行失常，使脈絡空虛不能上華于面，或瘀濁阻絡，蘊結肌膚是黃褐斑發病的主要原因。中醫藥治療黃褐斑講求內臟氣血陰陽平衡，注重調整臟腑功能，治以活血化瘀，疏肝解郁，滋補肝腎，健脾養血。或內治為主、或外治為主，或內外治并用。中藥治療黃褐斑歷史悠久，早在《神農本草經》、《名醫別錄》、《太平圣惠方》、《千金方》等古典醫籍中就明確記載了能夠“袪面黑，好顏色”的方藥。大量臨床實踐證明，中醫藥治療黃褐斑顯示出一定的優勢，具有突出整體調節、療效穩定、副作用小、患者易于接受等優點，療效比單純用西藥治療要好。但是，中藥治療黃褐斑仍存在療效緩慢、治愈率不高、療程較長、長期服用中藥不方便等缺點，影響了治療的依從性。
總之，中西醫治療黃褐斑的藥物和手段比較多，但或因療效過于緩慢、或因不良反應太多，一直未有一種療效顯著、安全、公認、令醫患都滿意的治療方案，這與臨床實際需要極不相符。因此，尋找組方合理、療效確切的中藥組方，并通過現代中藥提取技術制備成高效、安全的中藥美白袪斑提取物，已成為目前中醫藥美容領域的一個研究熱點。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種具有優異的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用的中藥復方提取物。本發明另一個目的是提出該中藥復方提取物在制備美白袪斑的藥物制劑、保健食品和化妝品中的應用。為了達到上述目的，本發明采取了以下技術方案組方藥材及比例為以重量份數計，白花敗醬草5份、文冠果種仁5份、白鮮皮3 份、仙鶴草3份、紅景天3份、決明子3份、柏子仁3份、金蕎麥3份、薄荷2份、甘草1份。以重量份數計，白花敗醬草5份、文冠果種仁5份、白鮮皮3份、仙鶴草3份、紅景天3份、決明子3份、柏子仁3份、金蕎麥3份、薄荷2份、甘草1份，稱取各藥材適量，混合粉碎，過藥典2號篩，藥粉裝入二氧化碳超臨界萃取裝置中，加入夾帶劑無水乙醇，用量為 0. 5ml/g藥粉，設定萃取溫度為45°C，萃取壓力為40MPa，解析I壓力為lOMPa、溫度為40°C， 解析II壓力為4MPa、溫度為25°C，萃取時間為池，得棕黃色粘稠油狀物。將上一步二氧化碳超臨界萃取后的藥渣，加入10倍量70%乙醇浸泡12小時，加熱回流提取2小時，過濾，向藥渣中再加入5倍量70%乙醇加熱回流提取2小時，過濾，合并濾液，減壓干燥得浸膏。將浸膏加適量水稀釋后與等體積的D-101型大孔吸附樹脂混合拌勻，上樣于D-101型大孔吸附樹脂柱中(上樣量以生藥量與樹脂量之比計算為1 2)，靜態吸附30分鐘，然后依次用 10個柱體積的水、10個柱體積的20%乙醇和10個柱體積的50%乙醇進行洗脫，收集50% 乙醇洗脫液，減壓干燥后粉碎，制得棕色粉末。將此粉末與二氧化碳超臨界萃取制得的棕黃色粘稠油狀物混合，即得本發明的中藥復方提取物。作為對上述技術方案的改進和補充1、組方中藥材的相對量可以按照白花敗醬草4-6份、文冠果種仁4-6份、白鮮皮 2-4份、仙鶴草2-4份、紅景天2-4份、決明子2-4份、柏子仁2_4份、金蕎麥2_4份、薄荷1_3 份、甘草1-2份的比例進行調整。2、在進行二氧化碳超臨界萃取時，萃取溫度可以設定為30_60°C。3、在進行二氧化碳超臨界萃取時，萃取壓力可以設定為20_60MPa。4、在進行二氧化碳超臨界萃取時，萃取時間可以設定為Ih或以上。5、在進行二氧化碳超臨界萃取時，夾帶劑可以為乙醇或濃度為95%以上的乙醇， 并且用量可以設定為0. 1-lml/g藥粉。6、在用旋轉蒸發儀對二氧化碳超臨界萃取液進行減壓濃縮回收乙醇時，溫度可以設定為45°C或以下。7、在對二氧化碳超臨界萃取后的藥渣進行提取時，提取溶劑可以是30% -100%乙醇。8、在對二氧化碳超臨界萃取后的藥渣進行提取時，提取方式可以是加熱回流提取、超聲提取或者滲漉提取。9、在對乙醇提取浸膏進行大孔吸附樹脂富集時，使用的柱脂可以是D-101型或者 AB-8型，以及其他非極性、弱極性或者中等極性大孔吸附樹脂。10、在對乙醇提取浸膏進行大孔吸附樹脂富集時，洗脫溶劑可以是水或不同濃度的乙醇，依照乙醇濃度由低到高依次洗脫。通過上述技術方案制備得到的提取物，具有明顯的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用，可以用于制備美白袪斑的藥物制劑、保健食品和化妝品。當將上述提取物混合進具有美白袪斑作用的藥物制劑和保健食品時，除這些提取物外，在不防礙本發明效果的范圍內，可以根據需要適當混合用于通常的藥物制劑和保健食品的其他成分中，例如交聯聚乙烯吡咯烷酮、羧甲淀粉鈉、微晶纖維素、乳糖、阿司巴坦、 硬脂酸鎂等內加輔料、外加輔料和包衣輔料。其型劑可以是任何一種藥學上所說的劑型，優選丸劑、片劑、膠囊劑或口服液。當將上述提取物混合進具有美白袪斑作用的化妝品及外用藥物制劑時，除這些提取物外，在不防礙本發明效果的范圍內，可以根據需要適當混合用于通常的化妝品、醫藥品等皮膚外用劑的其他成分中，例如油分、潤濕劑、紫外線吸收劑、抗氧化劑、表面活性劑、防腐劑、保溫劑、香料、水、醇、增稠劑等。本發明的提取物可用于化妝品及外用藥物制劑，特別適合廣泛用于化妝品中。其劑型只要是用于皮膚的劑型即可，可適用于溶液體系、可溶化體系、乳化體系、軟膏、凝膠等任意劑型。另外，其使用形態也是任意的，例如化妝水、乳液、 霜、面膜等。本發明中藥復方提取物是藥食兼用的純天然的植物提取物，隨后的藥效實驗將證明，本發明中藥復方提取物具有酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制的作用。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例應理解為僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。在閱讀了本發明記載的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求書所限定的范圍。為說明方便，以下將本發明提取物簡稱為TQW。實施例1 (TQW抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成的實驗研究)1實驗材料小鼠B16黑素瘤細胞(購于中科院上海細胞所)；熊果苷(購于Sigma公司)；DMEM 培養基(購于Gibco公司)；胎牛血清(購于Billab公司)；胰蛋白酶(購于Billab公司)；磷酸緩沖鹽(購于北京中杉金橋有限公司)；雙抗(購于Billab公司)；多巴(購于 Sigma 公司)JritonX-IOO (購于 Sigma 公司)；MTT (購于 Billab 公司)；DMSO (購于 Sigma 公司)；酶標儀(熱電上海儀器有限公司)。2試劑配制取熊果苷臨用時以DMEM培養基稀釋成實驗所需濃度。取TQW，用少量無水乙醇溶解，再用DMEM培養基溶解配成lmg/ml，其中乙醇濃度為 0.8%,調節PH值為7. 0，過濾除菌，4°C保存，備用。3細胞培養及受試藥物暴露
取小鼠B16黑素瘤細胞，待細胞生長至近融合狀態，經0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%小牛血清的DMEM培養液傳代，置于(X)2培養箱37°C、5% CO2飽和濕度環境中進行培養。每一次實驗取自同一傳代細胞。3. 1實驗分組空白組是在未接種細胞的孔中加入細胞培養液；陰性對照組是在接種了細胞的孔中加入細胞培養液；給藥組是在接種了細胞的孔中分別加入含不同濃度TQW的培養液；熊果苷組是在接種了細胞的孔中分別加入含不同濃度熊果苷的培養液。3. 2細胞增殖抑制率測定選擇生長至近融合狀態的細胞，用0. 25%胰酶消化，調整細胞濃度，以每孔5 X IO3 個接種于96孔板，每孔液體量150 μ L，置于37°C，體積分數為5% C02條件下培養24h后， 陰性對照組用新鮮培養液換液1次，給藥組和熊果苷組用添加受試藥物的新鮮培養液換液 1次，熊果苷、TQff濃度均分別設10 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml，每個濃度設12個復孔； 空白組只加培養液不加細胞；各組均置于37°C，體積分數為5 % CO2條件下培養72h，于結束前4h加入MTT 20 μ L/孔，37°C孵育4h后棄去上清液，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L/孔， 振蕩IOmin左右。用酶標儀測OD值，波長為490nm。 細胞增殖抑制率％ = [ 1-(給藥組OD值-空白組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)]X 100%3. 3酪氨酸酶活性抑制率測定選擇生長至近融合狀態的細胞，用0. 25%胰酶消化，調整細胞濃度，以每孔5 X IO3 個接種于96孔板，每孔液體量150 μ L，置于37°C，體積分數為5% C02條件下培養24h后， 陰性對照組用新鮮培養液換液1次，給藥組和熊果苷組用添加受試藥物的新鮮培養液換液 1次，熊果苷、TQW濃度均分別設10 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml，每個濃度設12個復孔；空白組只加培養液不加細胞；各組均置于37°C，體積分數為5% C02條件下培養72h，傾去培養液，用 PBS 洗兩次，加 TritonX-10090 μ L/ 孔，震蕩 30min,加入 0. 2% L-dopa溶液 60 μ L/ 孔，37°C孵育20min，用酶標儀測OD值，波長為490nm。酪氨酸酶活性抑制率％ = [1_(給藥組OD值-空白組OD值)/(陰性對照組OD 值-空白組OD值)]X 100%3. 4黑素含量抑制率測定選擇對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化，調整細胞濃度接種于培養瓶中，置于 37°C，體積分數為5% CO2條件下培養24h后，陰性對照組用新鮮培養液換液1次，給藥組和熊果苷組用添加受試藥物的新鮮培養液換液1次，熊果苷、TQW濃度均分別設10 μ g/ml、 50 μ g/mlUOO μ g/ml,每個濃度設12個復孔；空白組只加培養液不加細胞；各組均置于 37 0C，體積分數為5 % CO2條件下培養72h，用0. 25 %胰酶收獲細胞，離心(1500r/min，5min) 后棄去上清液，加PBS緩沖液調節細胞密度至105/ml左右，各吸取Iml細胞懸液分別置于3 個平行具塞管中，離心(1500r/min，5min)后棄去上清液，先加入200 μ 1蒸餾水使細胞重新懸浮，然后加入Iml乙醇乙醚液(體積比為1 1)以溶解非黑素的不透明顆粒，在室溫下放置15min，離心(3000r/min，5min)并棄去上清液，加入Iml質量分數為10%的二甲基亞砜、Imol/LNaOH溶液，置于80°C水浴30min，使細胞團塊完全溶解。用酶標儀測OD值，波長為490nm。
黑素含量抑制率％ = [1-(給藥組OD值-空白組OD值)/ (陰性對照組OD值-空白組OD值)]X 100%4結果分析4. ITQff對B-16細胞生長的影響由表1可見，TQW對細胞生長的抑制作用與同濃度熊果苷相比，差異均無統計學意義(P < 0. 05)，說明TQW的細胞生長抑制作用與傳統美白劑熊果苷相似，并且細胞毒作用較輕。4. 2TQW對B-16細胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影響由表2、3可見，TQW三個濃度均有顯著的抑制酪氨酸酶活性和黑素合成的作用，并且作用均強于熊果苷，說明在抑制酪氨酸酶活性和黑素合成方面，TQW比傳統美白劑熊果苷具有更明顯的作用。表ITQW對小鼠B16黑素瘤細胞增殖的抑制率(X±SD，％ )
權利要求
1.一種具有美白祛斑作用的中藥復方提取物，其提取方法如下以重量份計，按照白花敗醬草4-6份、文冠果種仁4-6份、白鮮皮2-4份、仙鶴草2-4份、 紅景天2-4份、決明子2-4份、柏子仁2-4份、金蕎麥2-4份、薄荷1_3份、甘草1_2份，稱取各藥材適量，混合粉碎，過藥典2號篩，藥粉進行二氧化碳超臨界萃取，以乙醇為夾帶劑，在一定的工藝參數下萃取得棕黃色液體，減壓濃縮回收乙醇，最終得棕黃色粘稠油狀物；再將上一步二氧化碳超臨界萃取后的藥渣，用適當濃度乙醇浸泡后提取，提取液干燥得浸膏，浸膏利用大孔吸附樹脂柱進行富集，在一定的工藝參數下制得棕色粉末；將此粉末與二氧化碳超臨界萃取制得的棕黃色粘稠油狀物混合，即得本發明的中藥復方提取物。
2.根據權利要求1所述的中藥復方提取物，其特征在于在對白花敗醬草、文冠果種仁、 白鮮皮、仙鶴草、紅景天、決明子、柏子仁、金蕎麥、薄荷、甘草的藥粉進行二氧化碳超臨界萃取時，萃取溫度為30-60°C，萃取壓力為20-60MPa，萃取時間為Ih或以上，夾帶劑無水乙醇用量為0. 1-lml/g藥粉，解析壓力為20MI^或以下，解析溫度為40°C或以下。
3.根據權利要求1所述的中藥復方提取物，其特征在于對二氧化碳超臨界萃取后的藥渣進行提取時，提取溶劑為30% -100%乙醇，第一次用量為10倍量，浸泡12小時，加熱回流提取或者超聲提取或者滲漉提取2小時，過濾，向藥渣中再加入5倍量30% -100%乙醇， 再提取2小時，過濾，合并濾液，減壓干燥得浸膏。
4.根據權利要求1所述的中藥復方提取物，其特征在于在對乙醇提取浸膏進行大孔吸附樹脂富集時，將浸膏加適量水稀釋后與等體積的D-101型大孔吸附樹脂混合拌勻，上樣于D-101型或者AB-8型，以及其他非極性、弱極性或者中等極性大孔吸附樹脂柱中，上樣量以生藥量與樹脂量之比計算為1 2，靜態吸附30分鐘，然后依次用10個柱體積的不同濃度的乙醇進行洗脫，收集20% -50%乙醇洗脫液，減壓干燥后粉碎，制得棕色粉末。
5.根據權利要求2所述的中藥復方提取物，其特征在于在進行二氧化碳超臨界萃取時，萃取溫度為45°C，萃取壓力為40MPa，萃取時間為池，夾帶劑無水乙醇用量為0. 5ml/g藥粉，解析I壓力為lOMPa、溫度為40°C，解析II壓力為4MPa、溫度為25°C。
6.根據權利要求3所述的中藥復方提取物，其特征在于對二氧化碳超臨界萃取后的藥渣進行提取時，提取方式為加熱回流提取、超聲提取或者滲漉提取。
7.根據權利要求4所述的中藥復方提取物，其特征在于對乙醇提取浸膏進行大孔吸附樹脂富集時，使用的柱脂為D-101型或者AB-8型，以及其他非極性、弱極性或者中等極性大孔吸附樹脂。
8.根據權利要求4所述的中藥復方提取物，其特征在于對乙醇提取浸膏進行大孔吸附樹脂富集時，洗脫溶劑為水或不同濃度的乙醇，依照乙醇濃度由低到高依次洗脫。
9.根據權利要求4所述的中藥復方提取物，其特征在于對乙醇提取浸膏進行大孔吸附樹脂富集時，將浸膏加適量水稀釋后與等體積的D-101型大孔吸附樹脂混合拌勻，上樣于 D-101型大孔吸附樹脂柱中(上樣量以生藥量與樹脂量之比計算為1 2)，靜態吸附30分鐘，然后依次用10個柱體積的水、10個柱體積的20%乙醇和10個柱體積的50%乙醇進行洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓干燥后粉碎，制得棕色粉末。
10.權利要求1-9中任何一項所述的中藥復方提取物在美白祛班的藥物制劑、保健食品和化妝品中應用。
全文摘要
本發明涉及一種具有美白祛斑作用的中藥復方提取物。本發明中的中藥復方提取物是以白花敗醬草、文冠果種仁、白鮮皮、仙鶴草、紅景天、決明子、柏子仁、金蕎麥、薄荷、甘草等十種中藥為原料，采用二氧化碳超臨界萃取技術和大孔吸附樹脂富集技術，在一定工藝參數下提取制得的提取物。該提取物具有顯著的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用，該提取物可以直接安全地應用于美白祛斑的外用藥物制劑及化妝品的制備。
文檔編號A23L1/29GK102362842SQ20111029136
公開日2012年2月29日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者任燕冬, 劉海洋, 周琦, 張寧, 祁永華, 耿放, 趙旭 申請人:耿放