專利名稱：三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因及其編碼蛋白和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，具體的說是一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子 PtALF-3基因及其編碼蛋白和應用。
背景技術：
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海產經濟蟹類，由于其營養價值豐富、生長迅速等優點，已成為我國重要海水養殖品種。但隨著養殖規模不斷擴大以及集約化程度不斷提高，由細菌、真菌等引起的多種疾病在三疣梭子蟹養殖群體中頻頻爆發，造成了巨大的經濟損失，嚴重制約了三疣梭子蟹養殖產業的健康可持續發展。由于對三疣梭子蟹的免疫系統缺乏深入了解，目前蟹病的防治仍主要采用傳統抗生素藥物防治，但長期盲目濫用藥物，造成抗藥性問題日益嚴重，非但難以有效地控制病情，反而帶來資金的浪費，蟹品質的下降，環境污染及對人類健康構成潛在威脅等不良后果。因此，這就迫切需要從三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病機制和開發新型的抗菌藥物進行免疫防治。抗脂多糖因子(ALF)是一種能夠結合脂多糖(LPS)并中和其毒性作用的小分子抗菌肽，因其作用機制與傳統抗生素不同，細菌不易產生耐藥性，對正常真核細胞無毒害，日益受到廣泛關注。ALF最初是從美洲鱟中發現，它可以結合LPS，并對R型革蘭氏陰性菌有明顯的抑制生長作用。晶體結構分析表明，鱟ALF結構中有兩個高度保守的半胱氨酸殘基， 它們形成二硫鍵所限制的β折疊區域即為LPS結合域。體外合成鱟ALF的LPS結合域，證明其確實可以與LPS結合，能夠在體外調節細胞因子的分泌，有助于保護小鼠免受內毒素的攻擊。隨后，從對蝦、螯蝦、蟹等甲殼動物中也鑒定或克隆出多種抗脂多糖因子。研究表明這些甲殼動物ALF的表達水平在細菌刺激后明顯上調，其重組蛋白能夠抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長，提示ALF在甲殼動物固有免疫中發揮重要作用。到目前為止，關于三疣梭子蟹抗脂多糖因子的報道較少。因此，識別、定性抗菌效應分子-抗脂多糖因子對研究三疣梭子蟹的免疫防御機制和進行病害防治具有重要的理論和實踐意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因及其編碼蛋白和應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3 基因為序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所示。三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因編碼蛋白所述PtALF-3基因編碼蛋白為序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示。
三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因編碼蛋白的應用所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因的重組表達產物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因的重組表達產物可作為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌的抑菌藥物。所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、愛德華氏菌，革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌，真菌為畢赤酵母。本發明所具有的優點本發明利用表達序列標簽技術(EST)、RACE技術從三疣梭子蟹中克隆到PtALF-3 基因cDNA全長序列，通過PCR技術擴增編碼PtALF-3成熟肽的基因片段并將其克隆到 pET32a(+)表達載體中，在大腸桿菌BL21(DE;3)-plysS實現體外重組表達。重組蛋白經 TALON柱純化和透析復性后，對革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛德華氏菌、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌，真菌畢赤酵母具有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為 0. 58μΜ、0· 58μΜ、9· 26μΜ、74· 08 μ Μ、18. 52μΜ、9· 26 μ Μ。本發明基因及其重組蛋白在藥物生產、免疫增強劑、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮劑生產中的應用，另外還可以進一步研究三疣梭子蟹免疫防御機制提供基礎，并為三疣梭子蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑。
圖1為本發明實例提供的純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3編碼成熟肽的基因擴增產物(其中，M =DNA marker, 1 成熟肽的基因擴增產物)。圖2為本發明實例提供的誘導和純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3重組蛋白(其中M 蛋白marker ;1 未誘導菌體中表達的蛋白；2 :IPTG誘導后表達的蛋白；3 純化的重組蛋白)。
具體實施例方式下面的實施例中將本發明作進一步闡述，但本發明不限于此。本發明中的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3的cDNA序列克隆包括下列步驟a)三疣梭子蟹總RNA的提取及mRNA的純化；b)三疣梭子蟹cDNA文庫構建；c)三疣梭子蟹cDNA文庫EST序列的大規模測定；d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtALF-3基因片段的篩選；e) RACE擴增獲得PtALF-3的全序列以及全序列的驗證。實施例1.三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因為SEQ ID No. 1中所示的堿基序列。序列表SEQ ID No. 1 為:ggggagtggg tgaggagcta ccagaaataa taacaacagc atcaaaagcaacgcccacca gttttcatca agtgttgccc ttgcttccct ccacgagcttccctcaag atg egg aaa gga gtg gtg gcc ggc ctg tgc ctggca ctg gtg gtg atg tgc ctg tac ctg ccc cag cct tgc gag
get cag tat gag get ctg gta act tcc att ctt gga aaa ctc act gga ctg tgg cac aac gac tcg gtg gac ttc atg ggc cac att tgc tac ttc cgc cgc cgc cct aag ate aga aga ttt aag ctg tac cac gag ggc aag ttt tgg tgt cct ggt tgg gcg cct ttc gag ggc agg tcg agg aca aag age agg tcg ggg tea tcc agg gag gcc acc aag gac ttc gtg cgc aaa get tta cag aac gga ctc gtc aca cag cag gat get tct ctg tgg ctg aat aac taa agcagaggaa gtgagtgctg tgtacgacga ggaggagaaa
gaggataaca tctcaaggga tgaacgtgat tttatagatt ccaccatcag agaaaaatag caaagaaatc ctttttttat acttgagctg ttacttgttg tgttaaataa
tgaaagtaac tgtctgactt cttgctggta aatgcaaggt ggaaagtcaa gtatgtgaag tttctaatgt acttgcgtct tgcctttgac acttatgcta
3. 3. 3. 3.3. 3. C 3.3.3. C 3. C 3.3.
catcatatct taactattat ggatgaggt aagaaaaagta
gtaatcatat attttttttt taatgaaact atggaggtag aagtaccaca tatatttttt ttgccttttt ctctcagttt aaaaacgaaa atgaaatgaa aatatataga agacgaaaaa aacggtagta agcctatttt atgaaacata tcttaattgc
ttggatcgta atagccgta agacttgaaaa agacattcag tatctctaaa ctctctataa gtgttaata aagatatatgc(a)序列特征 長度1057bp (有效長度 109-480) 類型堿基序列 鏈型單鏈 拓撲結構線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(f)特異性名稱CDS構建具體操作如下1.三疣梭子蟹總RNA的提取及mRNA的純化利用hvitrogen公司的Trizol試劑提取三疣梭子蟹總RNA，利用QIAGENE公司的Oligitex mRNA純化試劑盒純化mRNA。2.三疣梭子蟹cDNA文庫構建利用Clontech公司的Creator Smart cDNA Library Construction Kit試劑盒使用說明構建cDNA文庫。以純化后的mRNA為模板， SMART IV Oligonucleotide(5 ‘ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG 3')和 CDS III/3' PCRPrimer (5‘ ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T) 30Ν」Ν 3')為引物，在反轉錄酶(MMLV reverse transcriptase)作用下轉錄合成cDNA第一鏈。用5' PCR Prim er(5‘ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3')和CDSII1/3‘ PCR Primer(5‘ ATTCTAGAGGCCGAGG CGGCCGACATG-d (T) 30NJN3 ‘)為引物經 long distance (LD-PCR)合成 cDNA 第二鏈。雙鏈cDNA(ds cDNA)在45°C條件下經蛋白酶K(0. 8mg/ml)消化20min，然后用Sf Π酶進行酶切， 酶切產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit回收1-31Λ的片段。將回收的片段與載體pDNR-LIB連接后純化，通過電轉化導入大腸桿菌感受態細胞，37°C條件下220rpm/min培養lh，加入終體積20%的甘油，即為全長cDNA 原始文庫。3.三疣梭子蟹cDNA文庫EST序列的大規模測定文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引物M13F(5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3')在ABI3730xl測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*. abl，*. abd文件)數據經Phred程序處理轉化為序列文件(*. seq) 和質量文件(*. seq. qual)，依據質量文件提供的數值確定獲得序列的誤差概率，去除低質量的堿基，用cross-match程序屏蔽數據中的載體序列，從得到的數據中選取連續堿基質量大于Q13(準確率大于95% )且長度大于IOObp的序列作為EST數據，具體《基因表達序列(EST)數據分析手冊》(胡松年著，浙江大學出版社，2005年)。4.三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtALF-3基因片段的篩選將獲得的全部有效的EST數據進行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲得的Contigs與 Singletons在數據庫中進行BLASTn和BLASTx分析，結果顯示在EST序列中發現了與岸蟹抗脂多糖因子相似性較高(76% )的序列，根據相似性分析結果確定了三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因的EST序列。5.三疣梭子蟹PtALF-3基因cDNA全長序列的克隆根據與 PtALF-3基因同源的EST序列設計特異弓丨物Fl (5 ‘ ACGACGAGGAGGAGAAAGAGG 3 ‘)禾Π Rl(5 ‘ GGCACTGATGGTGGAAACTGA 3 ‘)，分別禾U 用載體通用引物 M13F(5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3')禾口 M13R(5' CAGGAAACAGCTATGACC 3')進 亍 3'禾口 5'末端的擴增。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用Axygen膠回收試劑盒進行 PCR產物回收和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，然后轉化大腸桿菌感受態Transl-Tl (北京全式金生物技術有限公司)，挑選陽性克隆用載體引物Μ13-47 和RV-M進行測序，所得結果經Wired/Wirap軟件進行拼接，得到三疣梭子蟹PtALF-3基因全長cDNA序列見SEQ ID No. 1。6.三疣梭子蟹PtALF-3基因cDNA全長的驗證在測序拼接的PtALF-3全長序列上設計一對引物 F2(5' GCTTCCCTCAAGATGCGGAAAG 3 ‘)和 R2(5' TTCAAGTCTTACGGCTATT 3')，以cDNA為模板進行全長的驗證。測序及分析同5。3' RACE擴增反應體系及反應條件25 μ 1反應體系
權利要求
1.一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因，其特征在于三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因為序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所示。
2.—種權利要求1所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因編碼蛋白，其特征在于所述PtALF-3基因編碼蛋白為序列表SEQ IDNo. 2中氨基酸序列所示。
3.一種按權利要求2所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因編碼蛋白的應用， 其特征在于所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因的重組表達產物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。
4.按權利要求3所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因編碼蛋白的應用，其特征在于所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因的重組表達產物可作為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌的抑菌藥物。
5.按權利要求4所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因編碼蛋白的應用，其特征在于所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛德華氏菌，革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌，真菌為畢赤酵母。
全文摘要
本發明屬于分子生物學技術領域，具體的說是一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因及其編碼蛋白和應用。本發明利用cDNA文庫和RACE技術從三疣梭子蟹中擴增到PtALF-3基因cDNA，該基因在三疣梭子蟹免疫防御方面發揮著重要作用。重組的PtALF-3蛋白對革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌和遲緩愛德華氏菌、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌、真菌畢赤酵母具有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為0.58μM、0.58μM、9.26μM、74.08μM、18.52μM、9.26μM。本發明為三疣梭子蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑開發奠定基礎。
文檔編號A23L3/3544GK102337272SQ20111029049
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月23日 優先權日2011年9月23日
發明者劉媛, 崔朝霞 申請人:中國科學院海洋研究所