專利名稱：腸道病毒三聯實時熒光定量rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，具體涉及一種三探針實時熒光定量RT-PCR檢測患兒糞便、咽式子、血液、腦脊液等樣本中腸道病毒通用型(EV)、 腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CA16)分型及定量的新方法。本品以腸道病毒高度保守的5’非編碼區(UTR)為靶序列，設計腸道病毒通用引物和腸道病毒通用型、腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型三色熒光標記探針，利用一步法三色實時熒光定量RT-PCR 技術，達到早期、快速、準確檢測所有腸道病毒及分型的應用目的。
背景技術：
手足口病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染病，以嬰幼兒發病為主。大多數患者癥狀輕微，以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征。少數患兒可出現中樞神經、呼吸系統損害，引發腦炎、急性弛緩性麻痹、腦水腫和心肌炎等，個別重癥患兒病情進展快，易發生死亡。腸道病毒屬的柯薩奇病毒(Coxsackie virus) A組16、4、5、7、9、10型，B組2、5型；埃可病毒(ECHO viruses)和腸道病毒71型 (EV 71)等均能引起手足口病。其中以EV 71及Cox A16型最為常見。二者所致的手足口病臨床難以區別。與CA16不同，EV71不僅引起手足口病，而且可引起嚴重中樞神經系統并發癥，如腦炎、腦膜炎、急性遲緩性癱瘓等，重者死亡。腸道病毒引起的手足口病、病毒性腦炎等疾病潛伏期一般為3 7天，沒有明顯的前驅癥狀，多數病人突然起病。早診斷、早治療至關重要。目前，對于腸道病毒引起的手足口病、病毒性腦炎等疾病實驗室仍缺乏快速、敏感、特異的診斷方法。傳統的腸道病毒檢測有病毒分離培養和血清學診斷，前者曾被視為腸道病毒診斷的“金標準”，但操作繁瑣、較為費時，一般需4-15天，且存在操作繁瑣、敏感性低，遠遠不能滿足疾病預防的“四早”要求； 而血清學診斷最常用的是中和實驗，即用微量板法測定抗體滴度，通常用急性期血清與恢復期血清滴度進行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是常常只能作為回顧性診斷的依據，而且容易與其它病毒產生交叉反應，所以抗體法無助于早期診斷。隨著分子生物學技術的迅速發展，應用聚合酶鏈反應技術為病原微生物的檢測提供了新的方向，特別近幾年興起的實時熒光定量PCR法。該方法通過對熒光信號的檢測實現對PCR過程中產物量的實時監測，并可精確計算出初始模板量。該法除定量準確、檢測快速外，其最大優點是采用完全閉管檢測，避免了交叉污染，廣泛被科研和臨床所接受。隨著熒光定量PCR檢測儀器的更新和染料科學的發展，不同腸道病毒屬間的檢測可用不同的熒光素標記特異探針，運用多重反轉錄熒光定量PCR( RT-qPCR)技術，可對臨床最常見的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Cox A16)同時進行檢測；而根據文獻報道和對腸道病毒屬脊灰病毒、柯薩奇、埃可病毒和腸道病毒68 71型等各型病毒株全基因組分析發現，各型腸道病毒5’非編碼區(UTR)存在著高度保守的區域，可以用來設計并擴增檢測所有腸道病毒株。從而實現對腸道病毒通用型、腸道病毒71型和柯薩奇病毒 A組16型三聯同時檢測。
發明內容
本發明的目的是提供一種腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒由定量RT-PCR反應液、標準品、對照品和盒體組成，其中定量RT-PCR反應液含有 RT-PCR緩沖液、MgCl2 , dNTPs、EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71型熒光探針、CA16 型熒光探針、耐熱DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、反轉錄酶(Primekript RTase酶)。檢測用引物分上游引物和下游引物
上游引物序列為CCCTGAATGCGGCTAATCC 下游引物序列為GATTGTCACCATAAGCAGCC 檢測用各分型熒光探針序列和各自的熒光素標記物 EV 通用型熒光探針為 FAM-ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - BHQ-I EV71 型熒光探針為HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - 3~ BHQ-I
CA16 型熒光探針為ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - BHQ-2
標準品序列為
CCCTGAATGC GGCTAATCCC ACGCACCCTC AACCCAGGCA ACTGCGGAGC ACACGCCCAC AAGCCAGCGG GTAGTGTGTC GTAACGGGCA ACTCTGCAGC GGAACCGACT ACTTTGGGTG TCCGTGTTTC CTTTTATCTT TATATTGGCT GCTTATGGTG ACAATC
對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陰性對照為無菌注射用水樣品，陽性對照為 EV71型滅活病毒株樣品，購自中山大學達安基因公司。本定量試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。本發明試劑盒使用方法
每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。標準品用無菌去離子水稀釋為IXlO4 — IX IO7拷貝。腸道病毒核酸RNA提取嚴格按照商品化核酸RNA提取試劑盒QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit (QIAGEN，CAT :5四04)操作，從臨床標本或病毒分離培養物中提取病毒RNA。取5μ1提取RNA作為RT-PCR模板。擴增檢測在三色(或以上)熒光定量PCR儀上進行，總體積25 μ 1，其中20. 0μ 1 PCR反應液，5 μ 1檢測樣品(提取產物、標準品、陽性或陰性對照)；探針檢測模式設置為 Reporter Dye :FAM, HEX和ROX通道，分別用于檢測EV通用型、EV71型和CA16型；反應條件45°C 10分鐘，1個循環，94°C 2分鐘，1個循環，94°C 15秒一60°C 60秒，40個循環。 設置完成后，保存文件，運行程序。熒光定量結果報告
1.如果檢測樣品的擴增曲線無對數增長期或Ct值>40，可判樣品為非腸道病毒 (NEV)；
2.如果檢測樣品Ct值<38，且曲線有明顯的對數增長期，可判樣品為陽性；
3.如果檢測樣品38< Ct值< 40，需要對樣品重新進行核酸提取和檢測操作，若再次實驗結果Ct值< 38，且曲線有明顯的對數增長期，判樣品為陽性；若Ct值> 38，可判樣品為陰性，具體是否屬于腸道病毒通用型、腸道病毒71型、柯薩齊病毒A組16型，請按照表1決定。
表1
ii^fe^i FiLT-F1CR 結巢果EV (-)EV71 (-),CAl6 (-)非腸道推『毒(NEV)EV ( + )EV71 (-),CAl6 (_)非 EV.71,CAl 6的其它腸道病毒EV ( + )EV71 ( + )’CAl6 (-)EV71EV ( + )EV71 (-),CAl 6 ( + )CAl 6本發明試劑盒通過一步法同時對腸道病毒通用型、腸道病毒71型和柯薩奇病毒A 組16型進行檢測分型，比起市場上現有的三個獨立分開的檢測試劑盒，不僅節約了生產成本和檢測成本，同時也提高了檢測的效率和時間；另外我們引入通用引物和分型探針設計技術，在保證沒有多對引物競爭的條件下隨機自動的達到多通道的檢測目的，上述的設計發明達到了效率和技術的統一。
圖1為本發明試劑盒的結構示意圖。圖2為腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR擴增圖。圖3為腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR標準曲線。
具體實施例方式本發明結合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。實施例1
參見圖1，本發明提供一種腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，該試劑由定量RT-PCR反應液1、標準品2、陽性對照品3、陰性對照品4和盒體5組成，其中定量 RT-PCR反應液1含有RT-PCR緩沖液、MgCl2 ,dNTPs、EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71 型熒光探針、CA16型熒光探針、耐熱DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、反轉錄酶(Primekript RTase 酶)。檢測用引物分上游引物和下游引物
上游引物序列為CCCTGAATGCGGCTAATCC 下游引物序列為GATTGTCACCATAAGCAGCC 檢測用各分型熒光探針序列和各自的熒光素標記物 EV 通用型熒光探針為 FAM-ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - BHQ-I EV71 型熒光探針為HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - BHQ-I
CA16 型熒光探針為ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - BHQ-2
標準品序列為
CCCTGAATGC GGCTAATCCC ACGCACCCTC AACCCAGGCA ACTGCGGAGC ACACGCCCACAAGCCAGCGG GTAGTGTGTC GTAACGGGCA ACTCTGCAGC GGAACCGACT ACTTTGGGTG TCCGTGTTTC CTTTTATCTT TATATTGGCT GCTTATGGTG ACAATC
陰性對照為無菌注射用水樣品，陽性對照為EV71型滅活病毒株樣品，購自中山大學達安基因公司。本發明試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。實施例2 腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒敏感度和特異性實驗
一、材料
選取病原微生物包括如下實驗組柯薩奇病毒A組16型，腸道病毒EV71型，柯薩奇病毒B組3型和埃可病毒30型等腸道病毒株；對照組甲型肝炎病毒，輪狀病毒，乙型炎病毒，人巨細胞病毒和肺炎支原體等，上述病源毒株均購自中山大學達安基因公司。二、引物及探針設計與合成
對腸道病毒UTR區核酸序列進行生物信息學分析，應用DNA STAR等軟件分析序列的同源性和各型的差異性，設計并篩選EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71型熒光探針、CA16 型熒光探針。上游引物序列為CCCTGAATGCGGCTAATCC
下游引物序列為5，一 GATTGTCACCATAAGCAGCC 一 3， EV 通用型熒光探針為 FAM-ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - BHQ-I EV71 型熒光探針為HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - BHQ-I
CA16 型熒光探針為ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - BHQ-2
均由上海生工公司合成。
三、檢測標準品制備
用上述引物擴增腸道病毒EV71型病毒株，在上游引物的擴增位點引入CA16型檢測探針序列CACGCACCCTCAACCCAGG，構建成一個同時擁有EV通用型、EV71型和CA16型均為單拷貝的一個重組序列片段；該片段提取純化后即用克隆系統插入PGEM-T-Easy克隆載體，抽提重組克隆質粒，用分光光度計對質粒進行定量，并用無菌水以10倍比稀釋質粒進行熒光定量PCR的敏感度實驗。四、檢測試劑盒特異性、敏感度和標準品相關系數分析
采用腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR試劑盒對上述常見病原微生物進行檢測，實驗組柯薩奇病毒A組16型，腸道病毒EV71型，柯薩奇病毒B組3型和埃可病毒30型等檢測均為陽性，且CA16型在通用型檢測通道(FAM通道)和CA16型檢測通道(R0X通道)為雙陽性，EV71型在通用型檢測通道(FAM通道)和EV71型檢測通道(VIC通道)為雙陽性。而對照組中的甲型肝炎病毒，輪狀病毒，乙型炎病毒，人巨細胞病毒和肺炎支原體等檢測結果均為陰性，特異性為100%;用構建的質粒標準品倍比稀釋后檢測敏感性達到10拷貝；用已知定量的濃度梯度標準品IO4 IO5 IO6 IO7四個濃度梯度做標準曲線，標準曲線中的ct值與標準質粒拷貝數之間有良好的線性關系(圖2、圖3)，腸道通用型、EV71型和CA16型的相關系數 R2 分別=0. 998,0. 996 和 0. 998。實施例3 腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒臨床樣本檢測應用一、標本檢測
6選取2010年5月 2010年10月手足口病流行期間，我院門診及住院的疑似手足口病患兒糞便標本192例和咽拭子標本215例。選取由中山大學達安基因股份有限公司提供的， 經國家食品藥品監督管理局注冊批準的腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒、EV71型核酸檢測試劑盒和CA16型核酸檢測試劑盒為對照，用于評價本申請試劑盒的性能指標。
二、臨床樣品對照檢測結果
糞便標本192例和咽拭子標本215例腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒和達安公司生產的單聯三管對照試劑結果見表2、表3
轟2 192例糞便樣本
權利要求
1. 一種腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，由定量RT-PCR反應液(1)、標準品(2 )、陽性對照品(3 )、陰性對照品(4 )和盒體(5 )組成，其中定量RT-PCR反應液(1)有 RT-PCR緩沖液、MgCl2 , dNTPs、EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71型熒光探針、CA16 型熒光探針、耐熱DNA聚合酶、反轉錄酶，檢測用上游引物序列為檢測用下游引物序列為5 - CCCTGAATGCGGCTAATCC -3 GATTGTCACCATAAGCAGCC-3“ EV 通用型熒光探針序列為5~FAM—ACACGGACACCCAAAGTAGTCG - 3~ BHQ-I EV71 型熒光探針序列為HEX—CACACGCCCACAAGCCAGC - 3~BHQ-I CA16 型熒光探針序列為ROX-CACGCACCCTCAACCCAGG - BHQ-2 標準品序列為CCCTGAATGC GGCTAATCCC ACGCACCCTC AACCCAGGCA ACTGCGGAGC ACACGCCCAC AAGCCAGCGG GTAGTGTGTC GTAACGGGCA ACTCTGCAGC GGAACCGACT ACTTTGGGTG TCCGTGTTTC CTTTTATCTT TATATTGGCT GCTTATGGTG ACAATC 陰性對照為無菌注射用水樣品，陽性對照為EV71型滅活病毒株樣品。
2.根據權利要求1所述的一種腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。
3.根據權利要求1所述的一種腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，標準品(2)用無菌去離子水稀釋為IXlO4 — IXlO7拷貝。
全文摘要
本發明提供一種腸道病毒三聯實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包含定量RT-PCR反應液、標準品、對照品，其中定量RT-PCR反應液含有RT-PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、EV通用引物、EV通用型熒光探針、EV71型熒光探針、CA16型熒光探針、耐熱DNA聚合酶、反轉錄酶。本發明試劑盒通過一步法同時對腸道病毒通用型、腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型進行檢測分型，比現有的單個檢測試劑盒，不僅節約了生產成本和檢測成本，同時也提高了檢測的效率和時間。并在保證沒有多對引物競爭的條件下隨機自動的達到多通道的檢測目的，達到效率和技術的統一。
文檔編號C12Q1/68GK102367488SQ20111028904
公開日2012年3月7日 申請日期2011年9月26日 優先權日2011年9月26日
發明者吳亦棟, 尚世強, 杜立中, 陳志敏 申請人:浙江大學