專利名稱：小球藻生物反應器的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種小球藻生物反應器的構建方法。它是一種條件溫和，低成本，便捷的，使外源基因安全地進入小球藻細胞的新方法。在生物技術領域建立小球藻生物反應器， 對于生產高價值產品，特別是來源緊俏的基因工程產品具有廣泛的應用前景。
背景技術：
橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)為綠藻門小球藻屬真核單細胞綠藻，是一種重要的綠色微藻資源。小球藻是一種理想的蛋白質資源，被聯合國糧食及農業組織(FAO) 列為二十一世紀人類的綠色營養源健康食品。小球藻具有原核生物的一些特點體積小、生態分布廣、易于培養、生長速度快、應用價值高。小球藻還含有葉綠素，可利用光能進行光合作用，像植物一樣自養生長，培養成本低廉。同時，作為真核藻類，它又具有真正的細胞核， 對于一些需要大量生產而又對原核生物生長不利的物質或表達需要翻譯修飾的復雜蛋白， 可利用小球藻生物反應器來生產。此外，小球藻不含內毒素，因而利用轉基因技術將小球藻改造成新型高效的生物反應器，對于生產高價值產品，特別是來源緊俏的產品具有廣泛應用前景。Maruyama認為在高場強及長時間的脈沖持續期，小球藻細胞可得到高的通透性，吸納外源DNA的能力較強。Maruyama等以小球藻(C. saccharophila)為受體，采用高壓電擊法，在600-900V電場強度，400ms脈沖持續時間的條件下，將質粒pBI221導入藻細胞， 并檢測到了 gus基因的瞬間表達(Maruyama M et al.，1994)。王逸云等在5000V脈沖電壓，50ms脈沖持續時間，脈沖次數為211次，循環次數為90次的高強度電場力條件下，將質粒 pBI121/phyAII轉入藻細胞(王逸云，2005)。張小宇等在6000-9000V脈沖電壓，20_50ms 脈沖持續時間，脈沖次數為21°條件下，將兔防御素基因NP-I轉入藻細胞，獲得了穩定表達外源蛋白質的小球藻生物反應器(張小宇，2006)。以上報道的方法可以將外源基因轉入小球藻，但是這些方法均存在著缺點與不足。首先，高強度或長時間持續脈沖損傷小球藻細胞；其次，實現上述高電壓及長時間脈沖刺激等實驗條件，必需具備價格昂貴的設備，增加了實驗成本和實驗難度。因此，尋找一種溫和、不需要專門設備的使外源基因安全地轉入小球藻細胞的新方法非常有必要。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種新的小球藻生物反應器的構建方法，可以克服現有技術的缺陷。本發明首先獲得了具有高通透性細胞壁的活體小球藻，溫和地導入基因載體及外源基因，使小球藻表達外源基因，建立小球藻生物反應器。本發明是一種溫和不需要專門設備以及安全的構建小球藻生物反應器的方法，利用本生物反應器成功地產出了 gus基因的表達產物。本發明提供的小球藻生物反應器的構建方法包括的步驟1)預培養篩選獲得高通透性細胞壁的活體小球藻
取對數生長期的小球藻液體培養物，接種量至SE培養基中25°C靜置培養，光照條件3000 40001x，每4h搖動一次，連續照明，培養3天。4000rpm離心，收集小球藻細胞。25°C靜置條件下，MBBM液體培養基預培養Mh，30°C條件下，用纖維素酶處理小球藻細胞4h，得到纖維素酶酶解的小球藻細胞培養液。2)小球藻生物反應器構建取步驟1)的小球藻培養液lmL，4000rpm離心5min，棄上清，用0. Snol/LNaCl 和0. 05mol/LCaCl2混合液ImL重懸細胞，將小球藻濃度調整到3 8X IO7個/mL ；27°C 下，取0. 4mL上述藻液至1. 5mL離心管中，加入25 μ L(l. 77ng/ μ L)攜帶gus基因的質粒 pSP-Ubi-GUS DNA{含kocin(博萊霉素)抗性基因ble}，同時做的陰性對照不加入質粒 pSP-Ubi-GUS DNA。靜置 15min。再分別加入 200 μ L 的 PNC 溶液(0. 8mol/LNaCl，0. 05mol/ LCaCl2,40% PEG 4000)，靜置 30min。4000rpm 離心 5min，棄去上清液，分別加入 ImL SEC 液體培養基(SE培養基中加入0. 5mol/L蔴糖)和2 μ L濃度為10mg/mL Zeocin (博萊霉素)， 混合均勻，分別涂布于含有10ug/mL Zeocin的SEC固體培養基(SEC培養基中加入1. 3% 的瓊脂)上，置于25°C培養箱中，光照條件3000 40001x靜置培養。挑取單藻落于含有 lOyg/mLkocin的SEC液體培養基中。培養物為小球藻生物反應器。對照組沒有藻落出現。接種于不含kocin的SEC固體培養基上的對照組有藻落出現。3)小球藻生物反應器中gus基因產物的檢測在無菌條件下，挑取kocin抗性的單藻落轉接入500 μ L含有10 μ g/mL Zeocin 的SEC液體培養基中，培養2 3天。8000rpm離心5min，收集藻體沉淀，加入0. ImL固定液(95%乙醇冰醋酸=3 1)固定30min。加入IOOyL⑶S染液，37°C下過夜染色。觀察藻液變化，呈現出藍色時證明gus基因已被轉入小球藻細胞，其表達產物將反應底物催化成新生物質。本發明提供的一種新的小球藻生物反應器的構建方法，首先獲得了具有高通透性細胞壁的活體小球藻，以溫和的簡便的新方法使外源基因安全地進入小球藻細胞。本發明不需要在高強度電場力或長時間電脈沖的電擊條件下來建立小球藻生物反應器，避免了小球藻細胞遭受高強度電場力或長時間電脈沖的打擊。利用本生物反應器成功地產出了 gus 基因的產物。
圖1、組織化學染色法對小球藻生物反應器所產gus基因產物的驗證。圖2、質粒pSP-Ubi-GUS的構建圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的說明，實施例僅為解釋性的，決不意味著它以任何方式限制本發明的范圍。1)藻種小球藻(Chlorella ellipsoidea)藻種由天津師范大學微生物實驗室篩選并保存，并且可以公開銷售。2)試劑=NaCl, HCl，KCl，EDTA, KNO3, NaNO3, H3BO3, KH2PO4, Na2EDTA, Ca (NO3)2, FeCl3 · 6H20, K2HPO4 · 3H20, MgSO4 · 7H20, CaCl2 · 2H20, MnCl2 · 4H20, ZnSO4 · 7H20, CuSO4 · 5H20,Na2MoO4 · 2H20，酵母粉，葡萄糖，山梨醇，甘露醇，以上實驗試劑均購于天津普博欣公司； 纖維素酶(Cellulase Onozuka R-10)，2-脫氧-D-葡萄糖購于日本Yakult Honsha公司；X-Gluc, TritonX-100, PEG 4000，Tris，乙酸鉀，冰乙酸，Na3PO4 (ρΗ7. 0), K3 [Fe (CN)6], K4[Fe(CN)6]，溶菌酶，蔗糖，蛋白胨均購于天津大學科威試劑有限公司Jeocin購于北京邁晨科技。SE 液體培養基(pH 7. 0) 0. 25g NaNO3,0. 075g K2HPO4 ·3Η20，0· 075g MgSO4 ·7Η20， 0. 025g CaCl2 · 2Η20，0· 175g KH2PO4,0. 025g NaCl，40mL 土壤浸提液，0. 005g FeCl3 · 6H20, ImL Fe-EDTA, ImL A5 混合液，958mL 蒸餾水。(Fe-EDTA :lg Na2 .EDTA，0. 081g FeCl3 ·6Η20， 50mL HCl (0. IN)，50mL 蒸餾水；A5 混合液:0. 286g H3BO3,0. 181g MnCl2 · 4Η20，0· 022g ZnSO4 · 7Η20，0· 0079g CuSO4 · 5Η20, IOOmL 蒸餾水)。MBBM 培養基(pH 7.0) :0. 5g NH4Cl，0.075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4, 0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉，ImL A6 混合液，7. 5g 2-脫氧-D-葡萄糖， 3. 75g 葡萄糖，用 dH20 定容到 1L。A6 混合液0. 28g H3BO3,0. 25g MnSO4 · 7H20，0. 0222g ZnSO4 · 7Η20，0· 0079g CuSO4 · 5Η20，0· 0021g Na2MoO4 · 2H20, IOOmL dH20。特別指出，本文中沒有特別注明的百分比均為質量百分比。3)質粒的構建取基因載體質粒 pSP124S (Lumbreras，V.，Stevens, D. R. and Purton, S. Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron. Plant J. 1998,14(4) :441-448)，將 pSP124S DNA 與 Ubi-gus基因⑴bi為啟動子)PCR產物分別用限制性內切酶Bam HI和Hin dill處理，分別得到具有粘性末端的DNA片段，使用DNA ligation Kit將DNA片段連接，構建重組DNA。 重組質粒命名為kocin抗性基因ble，攜帶外源gus基因，見圖2。4) GUS 染液:50mmol/L PBS 緩沖液(pH 7. 0)，5mmol/L 鐵氰化鉀(K3 [Fe (CN)6]), 5mmol/L 亞鐵氰化鉀{K4[Fe (CN)6] · 3H20} ,0. 3% X-葡萄糖醛酸苷(X-Gluc) ,0. 5% Triton X-100。5)實施步驟(1)提高小球藻細胞壁通透性從初始細胞密度為2. 86 X IO8個/mL的小球藻培養液中取對數生長期的小球藻液體培養物，1 %接種量至SE液體培養基中，25°C靜置培養，光照條件3000 40001χ，每4h搖動一次，連續照明，培養3天。分別取ImL培養液置于離心管中，4000rpm離心，除去SE液體培養基，收集藻細胞。分別按照表1所列實驗條件進行預培養。收集藻細胞分別加入含有不同量纖維素酶的高滲酶解緩沖液10. 025mol/L磷酸緩沖液(由0. 2mol/LNaH2P04 ·2Η20 和0. 2mo VLNa2HPO4 · 12H20配置而成)，pH 6. 0，含有0. 3mol/L山梨醇/甘露醇}，混勻，置于水溫30°C的水浴恒溫振蕩器中，轉速80rpm，酶解4h。表1各種酶解實驗條件
權利要求
1.一種小球藻生物反應器的構建方法，其特征在于包括以下步驟1)預培養篩選獲得高通透性細胞壁的活體小球藻取對數生長期的小球藻液體培養物，1 %接種量至PH7的SE液體培養基中，25°C靜置培養，光照條件3000 40001x，每4h搖動一次，連續照明，培養3天，4000rpm離心，收集小球藻細胞；25°C靜置條件下，MBBM液體培養基預培養Mh，30°C條件下，用纖維素酶處理小球藻細胞，得到具有高通透性細胞壁的小球藻細胞培養液；2)小球藻生物反應器構建取步驟1)的小球藻培養液lmL，4000rpm離心5min，棄上清，用0. 8mol/L NaCl和 0. 05mol/L CaCl2混合液ImL重懸細胞，將小球藻濃度調整到3 8X107個/mL ；27 °C 下，取0.4mL上述藻液至1.5mL離心管中，加入25 μ L(0D26Q 1.77)攜帶gus基因的質粒 pSP-Ubi-GUS 0嫩{含&0(^11，博萊霉素)抗性基因ble}，靜置15min ；再分別加入200 μ L的 PNC 溶液，其組成0. 8mol/L NaCl, 0. 05mol/L CaCl2,40% PEG 4000，靜置 30min ;4000rpm 離心5min，棄去上清液，分別加入ImL SEC液體培養基和2 μ L濃度為10mg/mL Zeocin,混合均勻，分別涂布于含有lOug/mL Zeocin的SEC固體培養基上，置于25°C培養箱中，光照條件3000 40001x靜置培養。挑取單藻落于含有10 μ g/mL kocin的SEC液體培養基中， 培養物為小球藻生物反應器；所述的SEC液體培養基的組成SE培養基中加入0. 5mol/L蔗糖所述的SEC固體培養基的組成SE培養基中加入1. 3%的瓊脂；3)小球藻生物反應器中gus基因產物的檢測在無菌條件下，挑取kocin抗性的單藻落轉接入500 μ L含有10 μ g/mL Zeocin的SEC 液體培養基中，培養2 3天；SOOOrpm離心5min，收集藻體沉淀，加入0. ImL固定液固定 30min ；加入100 μ L⑶S染液，37°C下過夜染色；觀察藻液變化，呈現出藍色時證明gus基因已被轉入小球藻細胞，其表達產物將反應底物催化成新生物質；所述的固定液組成95% 乙醇冰醋酸=3:1。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述的SE液體培養基的組成0.25g NaNO3, 0. 075g K2HPO4 · 3Η20，0· 075g MgSO4 · 7Η20，0· 025g CaCl2 · 2Η20，0· 175g KH2PO4, 0. 025gNaCl，40mL 土壤浸提液，0. 005g FeCl3 · 6H20, ImL Fe-EDTA, ImL A5 混合液，958mL 蒸餾水；Fe-EDTA :lg Na2 · EDTA，0. 081g FeCl3 · 6H20，50mL HCl (0. IN)，50mL 蒸餾水；A5 混合液:0. 286g H3BO3,0. 181g MnCl2 · 4H20,0. 022g ZnSO4 · 7H20,0. 0079g CuSO4 · 5H20, IOOmL 蒸餾水。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述的MBBM培養基組成0.5g NH4Cl, 0. 075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4,0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉， lmLA6混合液，7. 5g 2-脫氧-D-葡萄糖，3. 75g葡萄糖，用dH20定容至Ij IL ；A6混合液:0. 28g H3BO3,0. 25g MnSO4 ·7Η20，0· 0222g ZnSO4 ·7Η20，0. 0079g CuSO4 ·5Η20，0· 002IgNii2MoO4 ·2Η20， IOOmL dH20，pH7.0。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述的纖維素酶處理條件是由0.2mol/ LNaH2PO4 · 2H20 和 0. 2mol/L Na2HPO4 · 12H20 配置而成磷酸緩沖液，pH6. 0，含有 0. 3mol/L 山梨醇/甘露醇，混勻，置于水溫30°C的水浴恒溫振蕩器中，轉速80rpm，處理4h。
全文摘要
本發明涉及一種小球藻生物反應器的構建方法。它包括的步驟預培養篩選獲得高通透性細胞壁的活體小球藻、小球藻生物反應器構建和小球藻生物反應器中gus基因產物的檢測。利用本生物反應器成功地產出了gus基因的表達產物。本發明是一種條件溫和，低成本，便捷的，使外源基因安全地進入小球藻細胞的新方法。在生物技術領域建立小球藻生物反應器，對于生產高價值產品，特別是來源緊俏的基因工程產品具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102337217SQ20111028206
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者劉麗麗, 王艷琪 申請人:天津師范大學